一种鉴别太仓新毛芋艿的特异性分子标记及其筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于本发明属于分子标记鉴定领域，特别设及一种鉴别太仓新毛芋巧的特 异性分子标记及其筛选方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]芋（仿知casia 打紅（Xinnaeus) Schott)为天南星科（Araceae)芋属 (Colocasia)多年生草本植物，原产我国和印度、马来半岛等热带地区，世界上广为栽培。芋 的块茎、花、叶等器官可食用或做药用，有的国家或地区甚至将其作为主食。由于芋的栽培 历史悠久，其种质资源非常丰富。芋的染色体基数X=14,存在二倍体和Ξ倍体。我国研究人 员根据芋的球茎分葉、染色体数目及地理分布，将芋分为4类，即魅芋、魅子兼用芋、多头芋 和多子芋，其中魅芋通常为二倍体（2n=2x=28)，而魅子兼用芋、多头芋和多子芋通常为Ξ倍 体（2n=3x=42)。
[0004] W往对芋的鉴别，主要依据其形态学特征巧日生长习性、株高、叶形、叶色、母芋和 子芋的形状、重量和产量等）和生物化学指标巧日核型分析、同工酶等)。然而，运些鉴定方 法不仅操作繁琐，而且往往容易受环境条件等因素干扰，因此开发一种快速、稳定、准确的 芋品种鉴定方法极其重要。由于DNA水平上的分子标记能从本质上反应个体差异，并且不 受内外环境的影响，因此，近年来在芋的遗传变异方面得到广泛应用。如RAPD、ISSR、SSR、 AFLP等分子标记用于世界各地不同地区芋品种的种质资源评估、遗传多样性研究和聚类分 析等，研究发现，DNA分子标记在芋的不同品种间具有较高的遗传多样性，能够区分二倍体 和Ξ倍体品系，并且能够反映其地理来源等。近期，基于芋叶绿体基因组的成功测序，多个 叶绿体DNA分子标记也陆续开发出来，发现有些叶绿体片段在不同的芋品种间具有较好的 多态性，运为今后对芋的品种鉴定和遗传多样性分析等研究提供了参考。虽然目前DNA分 子标记技术在芋的遗传变异方面已取得了一定的研究成果，但大多研究集中在芋的遗传多 样性、亲缘关系等方面，因此目前在芋的品种鉴定方面的研究仍然较少，尤其在开发鉴定某 一特定芋品种特异性鉴别分子标记方面仍属空白。
[0005] 太仓新毛芋巧是苏州太仓的地方名特优品种，其母芋中等大小，圆形，子芋较多， 属多子芋类。芽红色，肉质懦而粘滑，味醇香，W食子芋为主。由于太仓新毛芋巧的优异品 质，于2014年被国家工商总局商标局核准为地理标志证明商标。但目前对太仓新毛芋巧的 鉴别主要依据其形态学特征，尚未开发出能够鉴定太仓新毛芋巧的专一性、特异性鉴别的 分子标记。
[0006] 本发明是首次对国家地理标志证明商标产品一-太仓新毛芋巧进行特异性鉴别 分子标记的开发，本发明提供的鉴定太仓新毛芋巧的特异性标记方法具有操作简单、灵敏 度高、重复性好等优点，能够实现对太仓新毛芋巧品种的特异性鉴定。本发明能够为其它优 质芋的品种鉴别提供技术参考，并且对于保护国家地理标志证明商标产品的种质资源具有 十分重要的意义。
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【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种鉴定太仓新毛芋巧的特异性分子标记，首先筛选出能够 在多子芋和魅芋中扩增出差异性序列的叶绿体片段引物，并针对差异的序列设计位点特异 性引物，从而将多子芋和魅芋区分开来。然后在多子芋品种中筛选能够在太仓新毛芋巧中 扩增出特异性条带的SSR引物，并针对特异性条带设计序列特异性引物，最终将太仓新毛 芋巧和其它芋品种区分开来，最终实现对太仓新毛芋巧的特异性鉴定，为芋的品种鉴别和 种质资源保护提供有力的技术支持。
[0009] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是： 能够在太仓新毛芋巧中扩增得到的特异性片段，该片段的核巧酸序列如SEQIDNO: 16所述。
[0010] 一组能够鉴别太仓新毛芋巧的SSR-SCAR引物，该引物对的核巧酸序列如SEQID NO: 17 和沈QIDNO: 18 所述。
[0011] 一种鉴别太仓新毛芋巧的特异性分子标记的筛选方法，所述的方法包括如下步 骤： (1)分别提取太仓新毛芋巧、苏优芋1号、泰兴香荷芋、海口香沙芋、扬芋1号、永泰红芽 芋、金坛红香芋，常熟香蕉芋、兴化龙香芋品种的基因组总DNA; (2 )W步骤（1)中的DNA为模板，采用6个叶绿体片段引物对其进行PCR扩增； (3) 分别将步骤（2)中的扩增产物进行切胶回收、克隆及测序； (4) 对步骤（3)中的测序结果进行序列比对，筛选能在多子芋和魅芋中扩增出差异序 列的引物，序列分别为SEQIDNO: 1和SEQIDNO: 2;用该引物在多子芋中扩增的序列 如沈QIDNO: 3~沈QIDNO: 9所述；而在魅芋中扩增的序列如沈QIDNO: 10~沈QID NO: 11所述。
[0012] (5)针对步骤（4)中多子芋和魅芋序列差异的区域设计位点特异性引物，序列如 沈QIDNO: 12 和沈QIDNO: 13 所示； (6) 用步骤（5)中设计的位点特异性引物在魅芋和多子芋中进行单株验证； (7) 采用16条SSR引物对7个多子芋品种进行PCR扩增，筛选到能够在太仓新毛芋巧 中扩增出特异性片段的引物如SEQIDNO: 14和SEQIDNO: 15所述，将扩增到的太仓新 毛芋巧的特异性片段进行切胶回收及测序，序列如SEQIDNO: 16所示； (8) 根据步骤（7)中的序列设计太仓新毛芋巧品种特异性引物，序列如SEQIDNO: 17 和沈QIDNO: 18所示； (9) 用步骤（8)中的引物在7个多子芋品种中进行单株验证，得到仅在太仓新毛芋巧中 能扩增出特异性条带的引物。
[0013] 有益效果：本发明提供了一种可W快速、准确地鉴定太仓新毛芋巧的特异性分子 标记及方法，对于开发芋的特异性品种鉴别体系及种质资源保护具有重要的意义。
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【附图说明】
[001引 图1是位点特异性引物（SEQIDNO: 12和SEQIDNO: 13)在多子芋和魅芋所 有个体中的扩增结果。其中1~8为苏优芋1号、9~15为泰兴香荷芋、16~21为海口香沙芋、 22~31为扬芋1号、32~41为永泰红芽芋、42~48为金坛红香芋、49~56为太仓新毛芋巧、 57~60为常熟香蕉芋、61~70为兴化龙香芋。Μ表示DNAmaker,marker中的条带大小由上 到下依次代表 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和lOObp; 图2是引物Taro02 (沈QIDNO: 14和沈QIDNO: 15)对7个多子芋品种的PCR扩 增图谱。其中1~7分别为：太仓新毛芋巧、苏优芋1号、泰兴香荷芋、海口香沙芋、扬芋1 号、永泰红芽芋和金坛红香芋。Μ表示DNAmaker,marker中的条带大小由上到下依次代表 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和lOObp; 图3是引物Taro02(SEQIDNO: 14和SEQIDNO: 15)在太仓新毛芋巧中扩增的特 异性序列； 图4是SSR-SCAR引物（SEQIDNO: 17和沈QIDNO: 18)在7个多子芋品种中的单株 验证结果。其中1~8为苏优芋1号、9~15为泰兴香荷芋、16~21为海口香沙芋、22~31为扬芋 1号、32~41为永泰红芽芋、42~48为金坛红香芋、49~56为太仓新毛芋巧。Μ表示DNAmaker， marker中的条带大小由上到下依次代表2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和lOObp。 [0016]
【具体实施方式】
[0017] 下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。引物均由南京锐真生物技 术有限公司合成；DNA提取试剂盒购自北京全式金公司，Taq酶和化2000 DNA marker购自 广州东胜生物科技有限公司，PMD19-T Vector和大肠杆菌D册α感受态细胞为化kara公司 产品；Tissue Lyser LT组织破碎仪为德国QIAGEN产品；核酸蛋白检测仪为美国巧pendorf 产品；PCR仪为BioMetra T1型。下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。
[0018]、植物基因组总DNA的提取 选择太仓新毛芋巧及江苏和福建地区通常栽培的总共9个芋品种(表1)，分别提取其 基