因组DNA。具体为：取植株幼苗的新鲜叶片100mg，经TissueLyserLT组织破碎仪将样 品进行破碎，利用EasyPurePlantGenomicDNAKit试剂盒，提取样品总DNAdDNA样品的 浓度及纯度用核酸蛋白检测仪进行检测，调整每个样品的DNA浓度至20ng/μL于-20°C 保存备用。
[0019] 表1实验材料表
2、 叶绿体片段的扩增 采用文献报道的6个叶绿体片段引物(表2)，引物交南京锐真生物技术有限公司合 成。PCR反应体系 20yL，包括：DNA模板（20ng/ML)1.0ML，2XReactionMix(含 20ml Tris-肥 1,100mlKC1，3mlMgCl2,400μΜ的dNTPs，漠酪蓝）10. 0 化，引物（10ml)各 1.0 ML，TaqDM聚合酶（2.5U/ML)0.4化，双蒸水补齐至20化。PCR条件为：94°C，7min预变 性；94°C变性lmin，50°C退火30s，72°C延伸45s，30个循环；最后72°C延伸10min。PCR 产物经1. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测，漠化乙锭（EB)染色，电压80V，电泳1h，W化2000作 为DNAm曰rker〇 [0020] 表2实验中使用的6对引物
3、 扩增产物的克隆及测序 上述扩增产物利用上海捷瑞生物工程有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离 屯、柱型)对该特异性条带进行回收、纯化。连接反应参照PMD19-TVector说明书，反应体系 10 化，包括W下组分：Vector1.0ML，SolutionI5.οML，DNA4.οML，4°C过夜连接。次 日，将连接产物转入大肠杆菌D册α感受态细胞。具体步骤为：取5. 0化连接产物加入感 受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42 °C热激90S，冰浴5min，加500化液体SOC溶液， 于37Γ，180rpm的摇床中培养1h，涂平板，放在培养箱中过夜培养。次日，挑取单菌落，用 通用引物M13和RV-M进行菌落PCR检验，将含有正确条带的克隆交由南京锐真生物技术 有限公司进行测序。
[0021] 叶绿体特异性片段的引物设计及验证 用Mega6. 0软件中的ClustalW程序，使用默认参数分别对获得的每个叶绿体片段的 测序结果进行序列比对，根据比对结果分析各品种间的序列差异。用Primer5.0软件针对 序列差异设计位点特异性引物，然后对9个芋品种的所有个体进行单株验证，反应体系同 步骤2。反应条件为：94°C，5min预变性；94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸45min, 30个循环；最后72°C延伸8min。
[00过引物的筛选 选择文献报道的SSR引物，由南京锐真生物技术有限公司合成。W7种多子芋的DNA个 体混合池为模板进行PCR反应。反应体系同步骤2。反应条件为：94°C，5min预变性；94°C 变性45 3,50°(：退火1111111，72°(：延伸1111111，40个循环；最后72°(：延伸10111111。扩增产物 经2%琼脂糖凝胶电泳，漠化乙锭（EB)染色，电压80V，电泳1.5h，2000bp的DNAladder (广州东盛生物科技有限公司）作为分子量标记。
[0023] 基于SSR-SCAR的引物设计及验证 选择在太仓新毛芋巧中扩增出特异性条带的引物，对特异性条带进行切胶回收，并将 回收的目的DNA片段进行克隆测序。根据测序结果，用Primer5.0软件设计一对特异性 引物对7个多子芋品种的所有个体进行单株验证。反应体系同步骤2。反应条件为：94°C， 5min预变性；94°C变性45s，50°C退火45s，72°C延伸1 111111，30个循环；最后72°(：延伸8 min。
【主权项】
1. 能够在太仓新毛芋艿中扩增得到的特异性片段，该片段的核苷酸序列如SEQIDNO: 16所述。2. -组能够鉴别太仓新毛芋艿的SSR-SCAR引物，该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所述。3. -种鉴别太仓新毛芋艿的特异性分子标记的筛选方法，所述的方法包括如下步骤： (1)分别提取太仓新毛芋艿、苏优芋1号、泰兴香荷芋、海门香沙芋、扬芋1号、永泰红芽 芋、金坛红香芋，常熟香蕉芋、兴化龙香芋品种的基因组总DNA; (2 )以步骤（1)中的DNA为模板，采用6个叶绿体片段引物对其进行PCR扩增； (3) 分别将步骤（2)中的扩增产物进行切胶回收、克隆及测序； (4) 对步骤（3)中的测序结果进行序列比对，筛选能在多子芋和魁芋中扩增出差异序 列的引物，序列分别为SEQIDNO: 1和SEQIDNO: 2;用该引物在多子芋中扩增的序列 如SEQIDNO: 3~SEQIDNO: 9所述；而在魁芋中扩增的序列如SEQIDNO: 10~SEQID NO: 11所述； (5) 针对步骤（4)中多子芋和魁芋序列差异的区域设计位点特异性引物，序列如SEQID NO: 12 和SEQIDNO: 13 所示； (6) 用步骤（5)中设计的位点特异性引物在魁芋和多子芋中进行单株验证； (7) 采用16条SSR引物对7个多子芋品种进行PCR扩增，筛选到能够在太仓新毛芋艿 中扩增出特异性片段的引物如SEQIDNO: 14和SEQIDNO: 15所述，将扩增到的太仓新 毛芋艿的特异性片段进行切胶回收及测序，序列如SEQIDNO: 16所示； (8) 根据步骤（7)中的序列设计太仓新毛芋艿品种特异性引物，序列如SEQIDNO: 17 和SEQIDNO: 18 所示； (9) 用步骤（8)中的引物在7个多子芋品种中进行单株验证，得到仅在太仓新毛芋艿中 能扩增出特异性条带的引物。4. 根据权利要求3所述的一种鉴别太仓新毛芋艿的特异性分子标记的筛选方法，其特 征在于，步骤（2)中PCR反应体系20yL，包括：20ng/^L的DNA模板1.0μL，10.0μL的 2XReactionMix，其中含20mMTris-HCl，100mMKC1，3mMMgCl2,400μΜ的dNTPs，溴酚 蓝，10mM的引物各1.0PL，2. 5U/^L的TaqDNA聚合酶0. 4μL，双蒸水补齐至20PL;PCR 条件为：94°C，7min预变性；94°C变性lmin，50°C退火30s，72°C延伸45s，30个循环；最 后72°C延伸10min;PCR产物经1. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭（EB)染色，电压80V， 电泳 1h，以DL2000 作为DNAmarker。5. 根据权利要求3所述的一种鉴别太仓新毛芋艿的特异性分子标记的筛选方法，其特 征在于，所述的步骤（6)进行单株验证时PCR反应体系同步骤（2)，反应条件为：94°C，5min 预变性；94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸45min，30个循环；最后72°C延伸8min。6. 根据权利要求3所述的一种鉴别太仓新毛芋艿的特异性分子标记的筛选方法，其特 征在于，步骤（9)中单株验证时反应体系同步骤（2)，反应条件为：94°C，5min预变性；94°C 变性45s，50°C退火45s，72°C延伸1min，30个循环；最后72°C延伸8min。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴别太仓新毛芋艿的特异性分子标记及其筛选方法，所述的能够在太仓新毛芋艿中扩增得到的特异性片段，该片段的核苷酸序列如SEQ？ID？NO:16所述。所述的筛选方法首先筛选出能够在多子芋和魁芋中扩增出差异性序列的叶绿体片段引物，并针对差异的序列设计位点特异性引物，从而将多子芋和魁芋区分开来。然后在多子芋品种中筛选能够在太仓新毛芋艿中扩增出特异性条带的SSR引物，并针对特异性条带设计序列特异性引物，最终将太仓新毛芋艿和其它芋品种区分开来，最终实现对太仓新毛芋艿的特异性鉴定，为芋的品种鉴别和种质资源保护提供有力的技术支持。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105368827
【申请号】CN201510700775
【发明人】沈雪林, 张艳梅, 戴华军, 孙小芹, 曹敏旭, 杭悦宇
【申请人】苏州市种子管理站, 江苏省中国科学院植物研究所
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年10月26日