与辣椒cmv抗性基因紧密连锁的分子标记gi1354及获取、应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体设及与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记 GI1354及获取方法和应用。
【背景技术】
[0002] 辣椒（CapicumannuumL.)是世界范围内广泛栽培的重要蔬菜作物。黄瓜花叶 病毒（化州mbermosaicvirus,CMV)是一种毁灭性病害，是危害辣椒的主要病毒之一。 CMV常引起辣椒叶型崎形皱缩，严重时植株萎缩，果实小而发硬，导致产量下降，品质降 低。CMV可严重影响辣椒的产量和品质，一般年份可造成辣椒减产20% -30%，严重时可达 50% -60%。在栽培生产过程中为防治辣椒CMV病害而频繁施用的化学农药，已经影响到 辣椒产品的食用安全，对人体健康构成了严重威胁，也对生态环境造成了污染。实践表明， 培育抗病品种是防治病害最经济有效的方法。同时发掘辣椒种质资源的优异抗CMV基因， 对其进行分子水平的遗传解析，对于明确抗病基因作用的分子机理和抗病育种具有重要意 义。
[0003] 辣椒CMV抗性遗传规律复杂，不同的抗原材料抗病遗传模式不同。根据系列研究 报道和发明人课题组做过的遗传规律研究，绝大多数CMV抗性材料抗性表现为数量性状遗 传模式，大家纷纷针对手中的CMV抗性材料进行了giL定位，但由于抗性材料不同或CMV毒 源不同，Q化定位结果相互间差异很大，难W比较。根据W往研究报道，仅有极少数材料CMV 抗性由单基因控制，如韩国报道B址ang的CMV抗性由单显性基因控制，并针对此单显性基 因开发出了紧密连锁的分子标记。然而至今，尚未有与辣椒CMV抗性单隐性基因紧密连锁 的分子标记的相关研究报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记GI1354。
[0005] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的：
[0006] 与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记GI1354,所述分子标记具有序列表中的 SEQIDN0:1~2的至少一个的核巧酸碱基序列。
[0007] 所述分子标记应用辣椒材料中cr基因的检测。
[0008] 所述检测包括W下步骤：
[0009] 辣椒材料基因组DNA提取步骤：对辣椒材料进行提取处理，得到辣椒材料基因组 DNA；
[0010]PCR扩增反应步骤：W所述分子标记作为PCR引物，W该辣椒材料基因组DNA作为 模板，进行PCR扩增反应，得到扩增产物；
[0011] 分析步骤：将所述扩增产物进行电泳分离处理，显色处理，再统计分析所述辣椒材 料是否含有cr基因。
[0012] 在上述检测优选的实施方式中，所述PCR扩增反应步骤中，PCR标记反应体系中含 有：
[001引 模板DNA0.5-2.0ng/yL正向、反向引物各l-lOng/yLdNTP各 100-500μπιο1/ レMgCl2l-5mmol/^，TaqDNA聚合酶0.1-0.5U/μレ体积百分比为10-20%的10XTaq Buffer;
[0014] 示例性地，所述PCR标记反应体系中各个成分的含量可w为w下任意值或任意值 之间的范围：
[001引 模板DNA0. 5ng/μL、Ing/μL、1. 5ng/μL、化g/μL，正向、反向引物各Ing/μL、 2ng/yL、6ng/yL、8ng/yL、10ng/yL，dNTP各 100ymol/L、200ymol/L、300ymol/L、 400μmol/L、500μmol/L，1的2lmmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L，TaqDNA 聚合酶 0.lU/yL、0. 2U/yL、0. 3U/yL、0. 4U/yL、0. 5U/yL，10XTaqBuffer:10%、12%、 15%、18%、20% ;
[0016] 优选地，所述PCR标记反应体系中含有：
[0017]模板DNA1.6ng/μL正向、反向引物各 5ng/μLdNTP各 100μmol/l，MgClz Immol/LTaqDNA聚合酶 0.lU/yL体积百分比为 10% 的lOXTaqBuffer。
[0018] 在上述检测优选的实施方式中，所述PCR扩增反应步骤中，PCR标记反应体系中含 有：
[0019] 体积百分含量为10-50%的模板DNA化5ng/μ L)，正向、反向引物巧化g/μ L)的 体积百分含量各5-15%，体积百分含量为40-60%的GoTaq吸Green Master mix ;
[0020] 示例性地，所述PCR标记反应体系中各个成分的含量可w为w下任意值或任意值 之间的范围：
[0021] 模板DNA化 5ng/yL) :10%、20%、30%、40%、50%，正向、反向引物巧0ng/μL) 各：5%、10%、12%、15%，G〇Taq够GreenMastermix:40%、45%、50%、55%、60% ;
[0022] 优选地，PCR标记反应体系中含有：
[002引体积百分含量为30%的模板DNA化5ng/μL)，正向、反向引物巧化g/μL)的体积 百分含量各10%，体积百分含量为50%的GoTaq饭GreenMastermix。
[0024]更优选地，10μL的PCR标记反应体系中含有：
[002引 3 μ L的模板DNA化5ng/ μ L)，正向、反向引物巧Ong/ μ L)各1 μ L，5 μ L的 Go TTag潑Green Master mix。
[0026] 在上述检测优选的实施方式中，所述PCR扩增反应步骤中，PCR反应程序为：94°C 预变性4min;94°C变性15s，55°C退火15s，72°C延伸30s，34个循环；72°C保溫5min。
[0027] 与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记GI1354的获取方法，包括W下步骤：
[0028] 将辣椒供试材料进行苗期抗病接种鉴定，W明确CMV抗性由单隐性基因cr控制； 再利用SSR引物和InDel引物进行筛选和分离，得到所述与辣椒CMV抗性基因cr紧密连锁 的分子标记GI1354。
[0029] 本发明的有益效果为：
[0030] 本发明直接将筛选获得的PCR引物作为分子标记使用，可W准确地检测到辣椒材 料是否含有cr基因，本发明方法方便、快捷、节约成本。
【附图说明】
[0031] 图1为实施例1中CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法的流 程示意图。
[0032] 图2为实施例1中花药培养步骤中得到的胚状体的照片。
[0033]图3为实施例1中再生植株培养步骤中得到的再生株的照片。
[0034] 图4为实施例1中驯化移栽步骤中得到的植株的照片。
[0035]图5为实施例2中辣椒幼苗单株CMV病情7级的植株的照片。
[0036] 图6为实施例2中辣椒幼苗单株CMV病情5级的植株的照片。
[0037]图7为实施例2中辣椒材料Q132CMV抗性连锁分析示意图。
[0038] 图8为实施例2中与辣椒cr基因连锁的genSSR分子标记的验证结果电泳图。
【具体实施方式】
[0039]W下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。
[0040] 实施例1 :
[0041] 本实施例为CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法和鉴定方法。 在获得CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的基础上，才有可能进行与辣椒CMV抗 性基因紧密连锁的分子标记的获取开发。
[0042] 其中，上述选育方法包括W下步骤，如图1所示。
[004引 （1)选取杂交材料：选取从国内外引进的四份优良辣椒杂交种："37-74"、"喜洋 洋"、"帕沃尔"、"圣保罗"。
[0044] 其中/'37-74"购自瑞克斯旺（中国）种子有限公司，"喜洋洋"购自昌乐新盛种业 有限公司，"帕沃尔"购自日本坂田种苗（苏州）有限公司圣保罗"购自纽内姆（北京） 种子有限公司。
[004引似杂交对上述四份杂交材料进行两两杂交："37-74"与"喜洋洋"杂交得到单交 杂种1，"帕沃尔"与"圣保罗"杂交得到单交杂种2;再将单交杂种1和单交杂种2杂交，得 到双交杂种。
[0046] (3)单倍体培育：将该双交杂种进行花药培养，再经过CMV人工接种抗性鉴定，得 到高抗CMV的DH株系Q132 (即为高抗CMV的辣椒材料Q132)。
[0047] ①选取花蕾：在上述双交杂种中，选择长势良好、无病虫害的植株作为供体植株， 严格按镜检结果选取小抱子发育处于单核靠边期一双核早期