专利名称：家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂靶标抗性的分子检测方法
技术领域：
本发明涉及家蝇对拟除虫菊酯类靶标抗性的分子检测技术，属于生物技术领域，适合用于家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的快速检测。
背景技术：
家蝇(Musca domestica)是一种重要的疾病传媒,据报道它可以传播100多种人畜疾病。家蝇也是重要的畜牧业害虫，家蝇的发生可以导致畜禽产品产量和质量的降低。因此家蝇种群的控制对于人类的健康和国民经济的发展都具有十分重要的意义。家蝇的防治长期以来主要依赖化学农药，抗药性问题突出。抗药性导致杀虫剂杀虫效率的下降，由此引发诸如杀虫剂使用次数和剂量增加，虫媒人畜疾病的流行等问题已给人类带来巨大损失。拟除虫菊酯杀虫剂(如溴氰菊酯)已广泛用于家蝇的防治，家蝇对这类杀虫剂普 遍产生了抗性。抗药性的检测是科学制定有效的防治措施的前提，对减少化学药剂对环境的污染和合理制定抗药性治理具有重要的指导意义。家蝇对拟除虫菊酯类的抗性的检测常采用生物测定，这种方法存在如下缺点(I)试验周期长一般需要24小时以上才能得到生测结果；(2)对试虫的数量和质量要求高为保证生测结果的准确性，需要使用特定生理状态的试虫；(3)难于检测早期抗性和预测抗性的发展趋势生物测定的方法只能记录杀虫剂剂量和试虫死亡率的信息，而无法测定个体的基因型。近年来，随着对家蝇抗药性抗性分子机制的了解，国内外开始尝试家蝇抗性的分子检测技术的研究。经过多年的研究发现，家蝇对拟除虫菊酯类抗性的主要机制之一是钠离子通道基因的点突变导致家蝇对农药的敏感性下降(即靶标不敏感性)。靶标不敏感主要是钠离子通道蛋白在1014位点的氨基酸变异(亮氨酸L变为苯丙氨酸F或组氨酸H，称为击倒抗性)以及918位点上的蛋氨酸(M)替换为苏氨酸(T)。918位点的抗性突变只见于存在1014F抗性突变的个体，这两抗性位点的突变组合称为超击倒抗性。至今，在国内外只建立了基于PCR的L1014F抗性突变的检测方法，而我们的研究发现，在我国，L1014H变异的频率更高，而且在高抗性家蝇品系中还存在M918T这一抗性相关的遗传变异。(Qiu X，Li M, Luo H, Fu T. 2007 Molecular analysis of resistancein a deltamethrin—resistant str ain of Musca domestica from China. PesticideBiochemistry and Physiolog y 89(2) :146-150)
发明内容
本发明是根据我们对我国各地家蝇抗药性机制的了解，提出了家蝇抗药性的分子检测方法，包括L1014F，L1014H, M918T三个抗性突变的检测方法。因此，本发明的目的是根据对我国各地家蝇抗药性机制的了解，建立可用于检测家蝇对拟除虫菊酯类靶标抗性的分子检测方法。本发明的一方面涉及一种家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂靶标抗性的分子检测方法，该方法包含下列步骤
(I)提取单头家蝇基因组DNA ；(2)对家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异进行分子检测；(3)对家蝇钠离子通道基因918位点抗性相关变异进行分子检测。其中，所述家蝇钠离子通道基因序列选自SEQ ID NO :10(钠离子通道基因1014L)、11(钠离子通道基因1014F)、12(钠离子通道基因1014H)、13 (钠离子通道基因918M)、14(GenBank登录号为EF592581，钠离子通道基因918T)所示。其中，1014的位点抗性相关变异为L1014F或L1014H，918位点抗性相关变异为M918T，可以使用PCR方法对家蝇钠离子通道基因编码的1014氨基酸位点和918氨基酸位点抗性相关的变异进行分子检测。在一个特定的实施方案中，对家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异的PCR检测使用下列5种PCR引物
PF :正向通用外引物，序列为 5’ -CAT GAT TGT GTT CCG AGT GC-3，(SEQ ID NO:
1);PR:反向通用外引物，序列为 5’ -CGA AGT TGG ACA AAA GCA AA-3’ (SEQ ID NO:
2)PL : 1014L 敏感基因特异性引物，序列为 5 ’ -TGG CCA CGT CAA CTTACC ACGAG-3’ (SEQ ID NO 3)PF 1014F抗性基因型特异性引物，序列为5’ -CCA CGG TCG TGA TCG GCAGTT-3’ (SEQ ID NO 4)PH :1014H抗性基因型特异性引物，序列为5’ -CAC GGT CGT GA TCGG CAA TCAT-3，(SEQ ID NO 5)其中，对每个个体设置3个PCR反应，分别使用三种不同的引物混合物，即Al (PF+PR+PL, 1:1:3 混合)，A2 (PF+PR+PF, 1:1:3 混合)，A3 (PF+PR+PH, 1:1:3混合)。PCR 反应程序为94°C 3min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，35 个循环；72°C IOmin0在另一个特定的实施方案中，对家蝇钠离子通道基因918位点抗性相关变异的PCR检测使用下列4种PCR引物SI :5，-TCA ACA CCA ACA CCA TTA CAT AT-3，(SEQ ID NO 6)S2 :5，-CGT GAT GGG AAT GCA ACT TTT CGG A_3，(SEQ ID NO 7)S3 :5’ -CAC TGA ATT TAC TCA TTT CGA TGA T-3’ (SEQ ID NO 8)S4 :5，-CCC ATT GTC CGG CCC G_3’ (SEQ ID NO :9)其中，PCR 反应中引物 S1、S2、
S3和 S4 的混合比例为 I : I : 3 : 3。PCR 反应程序为94°C 3min ；94V 30s, 50°C 30s,72°C 30s，30 个循环；72V IOmin0本发明的另一方面涉及上述方法在家蝇抗药性检测中的应用。本发明的第三方面涉及一种用于家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂靶标抗性检测的试剂盒，包括(I)用于提取单头家蝇基因组DNA的试剂；(2)用于对家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异进行分子检测的试剂；(3)用于对家蝇钠离子通道基因918位点抗性相关变异进行分子检测的试剂。在一个特定的实施方案中，用于对家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异进行分子检测的试剂包括下列5种PCR引物
PF :正向通用外引物，序列为 5’ -CAT GAT TGT GTT CCG AGT GC-3，(SEQ ID NO:
1);PR:反向通用外引物，序列为 5’ -CGA AGT TGG ACA AAA GCA AA-3’ (SEQ ID NO:
2)PL : 1014L 敏感基因特异性引物，序列为 5 ’ -TGG CCA CGT CAA CTTACC ACGAG-3’ (SEQ ID NO 3)PF 1014F抗性基因型特异性引物，序列为5’ -CCA CGG TCG TGA TCG GCAGTT-3’ (SEQ ID NO 4)PH :1014H抗性基因型特异性引物，序列为5’ -CAC GGT CGT GA TCGG CAA TCA T-3，(SEQ ID NO 5)在另一个特定的实施方案中，用于对家蝇钠离子通道基因918位点抗性相关变异进行分子检测的试剂包括下列4种PCR引物SI :5，-TCA ACA CCA ACA CCA TTA CAT AT-3，(SEQ ID NO 6)S2 :5，-CGT GAT GGG AAT GCA ACT TTT CGG A_3，(SEQ ID NO 7)S3 :5，-CAC TGA ATT TAC TCA TTT CGA TGA T-3，(SEQ ID NO 8)S4 :5，-CCC ATT GTC CGG CCC G_3，(SEQ ID NO 9)本发明相比现有技术有如下优点I.本发明建立的抗性分子检测技术与传统生物测定相比具有如下优点(I)需要生物材料少，数量在50-200头就可以满足检测要求；(2)对材料的要求低可以采用任何虫态的试虫，可以用活体，也可以用保存的样品，可以用整头家蝇，也可以用虫体的某一部位(如双翅)；(3)可以区分种群的杂/纯合状态有利预测种群抗性基因频率的变化趋势，便于抗性的早期诊断；(4)快速从DNA的提取到PCR产物的检测，数小时就可以完成。2.本发明与其它文献报道的用于家蝇靶标抗性检测的分子检测法方法(李春晓等特异性等位基因PCR扩增技术检测家蝇击倒抗性相关钠通道的基因突变。中国媒介生物学及控制杂志(2007)，18 (3) =255-256)相比，具有(I)覆盖面广不仅可以检测1014F,还可以检测1014H这一在我国自然种群家蝇中普遍存在的抗性基因型；(2)提供了 M918T抗性突变的快速检测方法用I个PCR反应就可以区分抗性与敏感基因型，而且M918T抗性突变意味着更高的抗性水平，该方法可以用于家蝇超击倒抗性的早期预警。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图IA-F为家蝇钠离子通道基因1014位点基因型检测结果。其中，M代表DNA分子量标记(50bp DNA ladder，天根公司)；A1 :反应所用引物为PF+PR+PL，按I : I : 3混合；A2 :反应所用引物为PF+PR+PF，按I : I : 3混合；A3 :反应所用引物为PF+PR+PH，按1:1: 3混合。其中图IA为1014L/L基因型电泳图；图IB为1014L/F基因型电泳图；图IC为1014F/F基因型电泳图；图ID为1014L/H基因型电泳图；图IE为1014F/H基因型电泳图；图IF为1014H/H基因型电泳图。图2为家蝇钠离子通道基因918位点基因型检测结果。其中，M代表分子量标记(50bp DNA ladder，天根公司)；RR :抗性纯合子；RS :杂合子；SS :敏感纯合子;B1_B5 :北京样品检测，显示全部敏感纯合。
具体实施例方式实施例I单头家蝇基因组DNA的提取方法(参考 Rinkevich FD et al. Frequencies of the pyrethroid resistancealleles of Vsscland CYP6Dlin house flies from the eastern United Strtes. InsectMolecular Biology (2006)，15 (2)，157-167)本发明所使用的家蝇株系来源如下所使用的家蝇RR(实验室抗性BJD品系，基因型为918T纯合)，RS (实验室抗性与敏感品系的杂交Fl代，基因型为918M/T杂合)，
SS (实验室敏感品系，基因型为918M纯合)，B1-B5,L/L，L/F，F/F，L/H，F/H，H/H基因型家蝇采自北京奥运村垃圾站以上品系家蝇均可得自中国科学院动物研究所(北京市朝阳区北辰西路I号院-5号)。(I)取单头家蝇(去腹部)置于I. 5ml体积的离心管(印pendorf管)中，加入
0.5ml裂解缓冲液，碾磨将虫体捣碎，置60°C温浴，20分钟后取出；(2)加75 μ I的8Μ醋酸钾，混匀，置冰上10分钟；(3) 14000g离心5min，取400 μ I上清液(避免取到沉淀)转至新的离心管；(4)加入800 μ I (上清液的2倍体积)100%冰冷乙醇，室温放置IOmin ；(5)离心10分钟，弃上清，沉淀用0. 5ml 70%乙醇清洗；(6)离心5分钟,沉淀干燥后,加入50 μ I水重溶。制备的DNA样品可直接用于后续的PCR，也可以将样品保存在4°C下备用，或在-20°C条件下长期保存。以上方法中使用的试剂配制方法如下(I)溶液A :含 IOOmM Tris HCl pH 8. O, IOmM EDTA, 50mM NaCl (高压灭菌，室温保存)；(2)0. 15M 精胺(spermine)(过滤灭菌,分装保存在 _20°C ) ； (Fluka 公司)(3) 0. 5M亚精胺(spermidine)(过滤灭菌,分装保存在_20°C ) ； (Fluka公司)(4) 20mg/ml蛋白酶K (过滤灭菌,分装保存在_20°C ) ; (Merck公司)(5)10% SDS，用溶液A配制，无须灭菌；(6) 8M醋酸钾(室温保存，IOOml水中溶解醋酸钾78. 51g)；(7)裂解缓冲液(现配现用):为溶液A含I % SDS ；0. 15mM精胺，O. 5mM亚精胺和0. lmg/ml (20U/mg)蛋白酶 K。实施例2家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异的分子检测(I)PCR引物一共有5条引物(委托Invitrogen公司合成)，其中PF:为通用外引物(正向)，序列为 5’ -CAT GAT TGT GTT CCG AGTGC-3，(SEQ IDNO 1)PR :为通用外引物(反向)，序列为 5，-CGA AGT TGG ACA AAA GCAAA-3’ (SEQ IDNO 2)PL :为1014L敏感基因特异性引物，序列为5’ -TGG CCA CGT CAACTT ACC ACGAG-3’ (SEQ ID NO 3)PF :为1014F抗性基因型特异性引物，序列为5’ -CCA CGG TCG TGA TCG GCAGTT-3’ (SEQ ID NO 4)PH :1014H抗性基因型特异性引物，序列为5’ -CAC GGT CGT GA TCGG CAA TCAT-3，(SEQ ID NO 5) (2)PCR反应设置每个个体设置三个PCR反应，分别使用三种不同的引物混合物，即 Al (PF+PR+PL, I I 3 混合)，A2 (PF+PR+PF, I I 3 混合)，A3 (PF+PR+PH,1:1: 3 混合^PCR反应体系为 20 μ 1，含 10XPCR缓冲液(Takara公司，IOOmM Tris-HCL,500mMKCL, 15mM MgCL2) 2. O μ 1，dNTP (2. 5mM) I. 5 μ I，引物混合物 I. 2μ I ；DNA I μ 1，Taq 酶(Takara 公司，r~Taq, 5U/ μ I) O. 2 μ I。(3) PCR 反应程序94 °C 3min ；94 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 30s, 35 个循环；72°C IOmin。(4) PCR产物的电泳检测将PCR产物在2. O %的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在160V，电泳20min后在紫外光下检测。各反应除了有285bp的参照条带外，根据另一条基因特异性引物产物的有无，来判断各个体的基因型。基因型判别方法见下表
~LTLL/F ~FVFL/HH/H ~FVH
~Ti285+140 285+140 285285+140 285285
A2285285+189 285+189 285285285+189
A3285285285285+189 285+189 285+189检测结果如图I所示。实施例3家蝇钠离子通道基因918位点抗性相关变异的分子检测(I)PCR引物引物有四条，其序列分别为SI :5，-TCA ACA CCA ACA CCA TTA CAT AT-3，(SEQ ID NO 6)S2 :5，-CGT GAT GGG AAT GCA ACT TTT CGG A_3，(SEQ ID NO 7)S3 :5，-CAC TGA ATT TAC TCA TTT CGA TGA T-3，(SEQ ID NO 8)S4 :5，-CCC ATT GTC CGG CCC G_3，(SEQ ID NO 9)(2)PCR反应设置PCR反应体系15 μ 1，含10XPCR缓冲液(Takara公司，IOOmMTris-HCL, 500mM KCL, 15mM MgCL2) I. 5 μ I, dNTP(2. 5mM) I. 2 μ 1，引物混合物 I. 2 μ I [=S1+S2+S3+S4 (O. 15 μ 1+0. 15 μ 1+0. 45 μ 1+0. 45 μ I) ]，DNA O. 5 μ I，Taq 酶(Takara 公司，r-Taq,5U/μ I)0. I μ I。(3) PCR 反应程序94 V 3min ；94 V 30s, 50 V 30s, 72 V 30s, 30 个循环；72°C IOmin。 (4) PCR产物的电泳检测
将PCR产物在2. 0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在160v，20min后紫外光下检测。如果在272bp和115bp有条带，说明该个体为敏感纯合子；如果在272bp和196bp有条带，说明该个体为抗性纯合子；如果在272bp，196bp和115bp有条带，说明该个体为杂检测结果如图2所示。
权利要求
1.一种家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂靶标抗性的分子检测方法，包含下列步骤 (1)提取单头家蝇基因组DNA; (2)对家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异进行分子检测； (3)对家蝇钠离子通道基因918位点抗性相关变异进行分子检测。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述家蝇钠离子通道基因序列选自SEQID NO10，SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :12，SEQ ID NO 13 和 SEQ IDNO :14。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中，所述家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异为L1014F或L1014H。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述家蝇钠离子通道基因918位点抗性相关变异为M918T。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的方法，其中，使用PCR方法对家蝇钠离子通道基因1014位点和918位点抗性相关变异进行分子检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤(2)中使用了下列5种PCR引物 PF :正向通用外引物，序列如SEQ ID NO :I所示； PR :反向通用外引物，序列如SEQ ID NO 2所示； PL :1014L敏感基因特异性引物，序列如SEQ ID NO :3所示； PF 1014F抗性基因型特异性引物，序列如SEQ ID NO 4所示； PH :1014H抗性基因型特异性引物，序列如SEQ ID NO 5所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(2)中每个个体设置3个PCR反应A1、A2和A3，其分别使用下列3种不同的引物混合物 Al PF+PR+PL, 1:1:3 混合； A2 PF+PR+PF, 1:1:3 混合；A3 PF+PR+PH, I I 3 混合。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，步骤(2)的PCR反应程序为94°C3min;94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，35 个循环；72°C IOmin0
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其中，步骤(3)中使用了下列4种PCR引物 51:序列如SEQ ID NO 6所示； 52:序列如SEQ ID NO 7所示； 53:序列如SEQ ID NO 8所示； 54:序列如SEQ ID NO 9所示。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，步骤(3)的PCR反应中引物S1、S2、S3和S4的混合比例为I : I : 3 : 3。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，步骤(3)的PCR反应程序为94°C3min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环；72°C IOmin0
12.权利要求1-11任一项的方法在家蝇抗药性检测中的应用。
13.一种用于家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂靶标抗性检测的试剂盒，包括 (1)用于提取单头家蝇基因组DNA的试剂； (2)用于对家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异进行分子检测的试剂； (3)用于对家蝇钠离子通道基因918位点抗性相关变异进行分子检测的试剂。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述家蝇钠离子通道基因序列如SEQID NO.10，11，12，13 和 14 所示。
15.根据权利要求13或14所述的试剂盒，其中，用于对家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异进行分子检测的试剂包括下列5种PCR引物 PF :正向通用外引物，序列如SEQ ID NO :I所示； PR :反向通用外引物，序列如SEQ ID NO 2所示； PL :1014L敏感基因特异性引物，序列如SEQ ID NO :3所示； PF 1014F抗性基因型特异性引物，序列如SEQ ID NO 4所示； PH :1014H抗性基因型特异性引物，序列如SEQ ID NO 5所示。 根据权利要求13-15中任一项所述的试剂盒，其中，用于对家蝇钠离子通道基因.918位点抗性相关变异进行分子检测的试剂包括下列4种PCR引物 .51:序列如SEQ ID NO 6所示； .52:序列如SEQ ID NO 7所示； .53:序列如SEQ ID NO 8所示； .54:序列如SEQ ID NO 9所示。
全文摘要
本发明涉及家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂靶标抗性的分子检测方法。采用根据家蝇钠离子通道基因的敏感与抗性基因型设计的特异性引物，以单头家蝇的基因组DNA为模板，进行钠离子通道基因片段的PCR扩增，根据对PCR产物的电泳检测，来区分家蝇个体的基因型，检测抗性基因型频率。本发明涵盖家蝇钠离子通道的1014F，1014H，918T三种抗性点突变的检测方法。该方法经济、快速、高通量、准确性高。
文档编号C12Q1/68GK102864209SQ20111018641
公开日2013年1月9日 申请日期2011年7月5日 优先权日2011年7月5日
发明者邱星辉, 李梅, 王庆敏, 周云辉 申请人:中国科学院动物研究所