早老素ps1基因环化基因序列及其表达方法和荧光定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种早老素PSl基因环化基因序列及其表 达方法和巧光定量检测方法；为阿尔茨海默病疾病的早期临床诊断提供了理想的诊断 m过rker。
【背景技术】
[0002] W往研究主要是在病毒中发现存在环状RNA(circularRNA，circRNA)，1993年 CocquerelIe等在人体细胞中发现了circRNA，在过去的30年间由于技术水平的限制，把运 部分客观存在的RNA忽略了，近年来，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研 究者才在哺乳动物体内发现大量客观存在的环状circRNA，环化RNA由于形成闭合的环状， 在生物体内非常的稳定，另外也有研究者在古细菌中发现了环状RNA.环状RNA由前体RNA 通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成，环状RNA通常是由一个W上外显子构成的 RNA分子。
[0003] 阿尔茨海默病（Alzheimer'Sdisease,AD)是一种不可逆性神经系统变性疾病， AD有家族遗传性和散发性两种。家族遗传性老年性痴呆（FamilialAlzheimerDisease, FAD)又分为早发型巧OFAD)和晚发型化OFAD)，被认为是常染色体显性遗传疾病。通过基 因扫描和定位克隆方法已筛选出4种与AD明确相关的致病基因，即位于21qll. 2 - 21q21 区域的APP基因、19ql3 - 13. 2区域的APOE基因、14q24. 3区域的早老素I(PSl)基因、和 lq31 - 42区的早老素PS2基因，其中PSl基因可能是EOFAD的主要责任基因。早老素基因 PSl是丫-分泌酶的核屯、组成成分，丫-分泌酶复合物是由四个膜整合蛋白组成的包含19 次跨膜螺旋的复合体，包括PSl,Aph-IJen-2和Nicastrin四个亚基，其中早老素PSl是执 行酶活功能的膜整合蛋白酶活性亚基，任何一个亚单位的表达水平降低都会导致酶复合体 形成障碍。
[0004] 对人的早老素基因PSENUpresenilin1，PS1)基因的全长RNA序列进行分析， PSl(基因登录号NM_000021. 3)mRNA由12个外显子组成；有文献报道环状RNA在生物体内 大量存在，多是由外显子参与环化；然而，目前在运一领域并没有更深入的研究。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种早老素PSl基因环化基因 序列，为阿尔茨海默病疾病的早期临床诊断提供了理想的诊断marker。
[0006] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 早老素PSl基因环化基因序列，PSl基因的第2和第5外显子首尾连接环化，早老 素PSl基因环化基因序列的编码区的核巧酸序列为SEQIDNO. 1所示。
[0008] 进一步的，上述方案中，PCR扩增所述早老素PSl基因环化基因序列的引物序列为 下列引物对中的一对：
[0011] 早老素PSl基因环化蛋白，早老素PSl基因环化蛋白的核巧酸序列为SEQIDNO.I 所示。
[0012] 本发明的另一目的在于提供所述早老素PSl基因环化基因序列的表达方法，通 过反向PCR后克隆测序的方法在人神经母细胞瘤SY5Y细胞系中鉴定出了人早老素基因 P沈Nl(presenilin1，PS1)的一种环化的分子。
[0013] 一种早老素PSl基因环化基因序列的表达方法，所述表达方法步骤如下：
[0014] 1)提总RNA:提取甜-SY5Y细胞的总RNA;
[001引。除去提取的RNA中残留的基因组DNA:在上述提取的总RNA中加入反应液，经过 消化、灭活后除去残留的基因组DNA ;
[001引扣将RNA逆转录成CDNA :在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引 物，在PCR体系中逆转录成CDNA ;
[0017] 4)引物设计及PCR扩增克隆测序：根据PSl基因的RNA序列设计12对反向PCR扩 增引物SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 25,先反向扩增PCR扩增PSl的外显子，电泳检测PCR产 物，然后将PCR产物克隆到PMD18-TA克隆载体中，用上述引物进行PCR反应，反应完取PCR 产物电泳；将PCR产物切胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化，然后用T4连接酶将目标片段 连接到PMD18-TA克隆载体中，再将产物转化到D册a大肠杆菌，过夜培养；第二天挑取单克 隆做DNA测序鉴定，第2和第5外显子首尾连接环化，即CDNA核巧酸序列如SEQ ID NO: 1 所示的早老素PSl基因环化基因序列。
[0018] 进一步的，上述表达方法中，步骤4)的PCR反应体系为20微升体系：具2XPCR MIXIOyL，IOmM上、下游引物各1化，cDNA模板1化，用灭菌水补足20yL;反应条件为： 95°C5min预变性，循环内95°C80s变性，58°C80s退火，72°C延伸30s，共30个循环，PCR反 应循环后72°C继续延伸5min，然后16°C保存。
[0019] 进一步的，上述表达方法中，步骤1)采用Lifetechnologies公司生产的 T财Z0.1? Reagent试剂盒提取总RNA。
[0020] 进一步的，上述表达方法中，步骤2)的反应液总体积为20^以由如下组分组成：
[0021] RNA 如 L DNase I 2 睐 IOxbuffer 2|iL H,0(RNase free) 10冲；
[002引步骤1)提取的提取的总RNA在上述反应液中于37°C消化30min后，加入0.5y1 邸TA, 65°C灭活IOmin。
[0023] 进一步的，上述表达方法中，步骤3)逆转录的PCR体系为：
[0024] RNALSjig 民andom引勒 0.5]iL 2 X民T Mix 5山L RT Enzyme Mix I)xL
[00巧]RNase free(1地2〇uptoI补足至 10yL;
[0026]反应条件为：25°C5min，42°C20min，85°C5min，4°C2min。
[0027] 早老素PSl基因环化基因序列的巧光定量检测方法，该巧光定量检测方法包括W 下步骤：
[0028] I)提总RNA:提取甜-SY5Y细胞的总RNA;
[002引。除去提取的RNA中残留的基因组DNA:在上述提取的总RNA中加入反应液，经过 消化、灭活后除去残留的基因组DNA;
[0030] 3)将RNA逆转录成CDNA:在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引 物，在PCR体系中逆转录成CDNA;
[0031] 4)采用巧光定量反应Real-timePCR试剂盒，配置反应体系对老年痴呆患者血液 标本进行检测，体检测反应体系如下：
[0032] CDNA ]0冲 上游引物 0.5咕 下游引物 0.5地 2xSYB民Gr燃打PL民M游terMfe 1邸L dH,() 8 0以
[0033]其中，上游引物为：5，TGTATAAATACAGGTGCTATAAGACCTAA3，
[0034]下游引物为：5'TGCAGGTAACTCTGTCATTGG;
[0035] 巧光定量PCR反应条件为95°C5分钟变性；95°C10秒，60°C35秒；40个循环，溫 度6(TC-95°C收集巧光信号，然后进行融解曲线分析。
[0036] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0037] 1.本发明针对12个外显子分别设计反向PCR引物，来扩增可能存在的环化的 RNA;获得了一种由PSlmRNA的第2、3、4、5外显子环化而成的环化基因序列，此环化基因序 列全长序列为615个核巧酸；
[003引 2.本发明所述的早老素PSl基因环化基因序列可成为更加理想的检测阿尔茨海 默的早期临床诊断指标；W后对PSl基因环化基因生理学功能的和开发预防治疗阿尔茨海 默的祀点药物打下基础。
[0039] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0040] 图1为本发明的实施例1的早老素PSl基因环化基因DNA序列测定峰图结果图， 其中，箭头指示为环化连接点；
[0041] 图2为PSl基因mRNA模式结构图图示显示基因由12个外显子组成；
[0042] 图3为实施例1-12PCR扩增的环状PSl琼脂糖电泳图共12个泳道M为DNA分子 量marker,其中1-12分别对应实施例1-12;
[0043] 图4为本发明所述的早老素PSl基因环化基因组成结构示意图；
[0044] 图5为本发明所述的早老素PSl基因环化基因巧光定量检测引物设计模式图；
[0045]图6为巧光定量检测中线性PSl基因巧光定量引物设计模式图；
[0046] 图7为应用实施例1中早老素PSl基因环化基因在正常组和病人组表达性差异 图；
[0047] 图8为线性PSlmRNA在正常组和病人组表达性差异图。
【具体实施方式】
[0048] 进一步的，上述方案中，PCR扩增所述早老素PSl基因环化基因序列的引物序列为 下列引物对中的一对：
[0050] 早老素PSl基因环化蛋白，早老素PSl基因环化蛋白的核巧酸序列为SEQIDNO. 1 所示。
[0051] 本发明的另一目的在于提供所述早老素PSl基因环化基因序列的表达方法，通 过反向PCR后克隆测序的方法在人神经母细胞瘤SY5Y细胞系中鉴定出了人早老素基因P沈Nl(presenilin1，PS1)的一种环化的分子。
[0052] -种早老素PSl基因环化基因序列的表达方法，所述表达方法步骤如下：
[0053] 1)提总RNA:提取甜-SY5Y细胞的总RNA;
[0054]。除去提取的RNA中残留的基因组DNA:在上述提取的总RNA中加入反应液，经过 消化、灭活后除去残留的基因组DNA;
[005引 3)将RNA逆转录成CDNA:在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引 物，在PCR体系中逆转录成CDNA;
[0056] 4)引物设计及PCR扩增克隆测序：根据PSl基因的RNA序列设计12对反向PCR扩 增引物SEQIDNO. 2-SEQIDNO. 25,即P1-P12,先反向扩增PCR扩增PSl的外显子，电泳检 PCR产物，然后将PCR产物克隆到PMD18-TA克隆载体中，用上述引物进行PCR反应，反应 完取PCR产物电泳；将PCR产物切胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化，然后用T4连接酶将 目标片段连接到PMD18-TA克隆载体中，再将产物转化到D册a大肠杆菌，过夜培养；第二天 挑取单克隆做DNA测序鉴定，第2和第5外显子首尾连接环化，即CDNA核巧酸序列如SEQ IDNO: 1所示的早老素PSl基因环化基因序列。
[0057] 进一步的，上述表达方法中，步骤4)的PCR反应体系为20yL体系：2XPCRMIX 10化，IOmM上、下游引物各I化，cDNA模板I化，用灭菌水补足20yL;反应条件为： 95°C5min预变性，循环内95°C80s变性，58°C80s退火，72°C延伸30s，共30个循环，PCR反 应循环后72°C继续延伸5min，然后16°C保存。
[0058] 进一步的，上述表达方法中，步骤1)采用Lifetechnologies公司生产的 TRIz〇r"Reagent试剂盒提取总RNA。
[0059] 进一步的，上述表达方法中，步骤2)的反应液总体积为20^以由如下组分组成：
[0060] RNA 6uL DNase T 解 10 Xtoft紅 2曲 化0(RNase fVee) 10胖;
[0061] 步骤1)提取的提取的总RNA在上述反应液中于37°C消化30min后，加入0. 5y1 邸TA, 65°C灭活IOmin。
[0062] 进一步的，上述表达方法中，步骤3)逆转录的PCR体系为：
[0063] 瞄始 1.5