用于检测烟草对tmv抗性的n基因特异性引物对、检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于检测烟草对TMV抗性的N基因特异性引物对、检测方法及试剂盒，特异性引物对包括上游引物和下游引物；上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。检测方法为：在烟草N基因序列特异区域设计一对特异性引物；以待测烟草品种的DNA为模板，使用N基因特异性引物对进行PCR扩增；采用电泳检测PCR扩增产物，判断PCR扩增产物是否含有865bp的特征条带，如果含有，则对TMV具有抗性；反之，则不具有N基因介导的TMV抗性。具有操作简便、结果可靠、检测速度快等优点，能够极大地加速抗TMV育种材料的选育过程，缩短育种周期，提高育种效率。
【专利说明】用于检测烟草对TMV抗性的N基因特异性引物对、检测方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种用于检测烟草对TMV抗性的N基因特异性引物对、检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]烟草普通花叶病(TMV, tobacco mosaic virus)是全世界烟草栽培区发生普遍、危害严重的一大病害。发病后，烟叶产量降低，品质变劣，对烟叶生产带来极大危害。目前，对于TMV的防治没有效果较好的药剂，只能采取提前预防、综合防治等措施，由于受耕地资源紧张、连作的影响，培育抗TMV的烟草品种在生产中显得尤为迫切和重要。
[0003]N基因起源于野生种黏烟草(Nicotiana glutinosa),是目前已经明确的烟草抗TMV基因，是烟草抗TMV育种的主要抗源。1938年，F.Q.Holmes等研究表明，黏烟草对TMV的抗性是由显性单基因N基因控制的；1994年，S.Whitham等通过转座子标签法克隆得到N基因，并证明其介导的TMV抗性可以产生过敏性坏死反应。N基因全长为6656bp，包括5个外显子和4个内含子，编码NS和NL两种转录产物，属于TIR-NBS-LRR类抗病基因。国外已经利用N基因介导的TMV抗性育成了一批高抗TMV的烟草品种，包括Ky56、By21、NC75、VA770、TN86、Colerl76、Coker86等。我国也利用该抗源培育了一系列抗TMV品种(系)，如:利用Ky56作为亲本育成了辽烟8号、辽烟10号等抗TMV品种；利用Coker86的抗病性，育成了辽烟13、辽烟14等抗TMV品种。这些品种在我国的烟草生产中发挥了重要作用。
[0004]在传统的抗TMV育种中，为鉴定所培育的品种是否具有TMV抗性，通常采取田间鉴定方法，即:需要对育种材料进行单株接种并创造合适的发病条件，因此，如果接种不成功或条件不合适，均会影响品种抗性判断结论，具有品种抗性判断效率低的不足。
【发明内容】
[0005]针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种用于检测烟草对TMV抗性的N基因特异性引物对、检测方法及试剂盒，利用N基因特异引物序列检测不同育种材料TMV抗性，为烟草抗TMV育种提供一条快捷有效的方法，不受生长条件和发育时期的影响，可以快速高效的检测N基因控制的TMV抗性，加快抗TMV种质资源和优良品种筛选，还具有操作简便、结果可靠、检测速度快等优点，能够极大地加速材料的选育过程，缩短育种周期，提高育种效率。
[0006]本发明采用的技术方案如下:
[0007]本发明第一目的为提供一种用于检测烟草对TMV抗性的N基因特异性引物对，包括上游引物NPF和下游引物NPR ；
[0008]所述上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0009]所述下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0010]本发明第二目的为提供一种烟草是否具有N基因介导的TMV抗性的检测方法，包括以下步骤:
[0011]SI,利用Genbank提供的烟草基因组序列进行Blast比对，查找被检测烟草的N基因序列特异区域，并在该特异区域设计N基因特异性引物对；其中，所述N基因特异性引物对包括:上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示；
[0012]N基因序列特异区域的序列如下:
【权利要求】
1.一种用于检测烟草对TMV抗性的N基因特异性引物对，其特征在于，包括上游引物NPF和下游引物NPR ； 所述上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示； 所述下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.一种烟草是否具有N基因介导的TMV抗性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: SI，利用Genbank提供的烟草基因组序列进行Blast比对，查找被检测烟草的N基因序列特异区域，并在该特异区域设计N基因特异性引物对；其中，所述N基因特异性引物对包括:上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ IDN0:2所示； S2，提取被检测烟草品种的DNA ； S3，以所述被检测烟草品种的DNA为模板，使用所述N基因特异性引物对对所述被检测烟草品种的DNA进行PCR扩增； S4,采用电泳检测PCR扩增产物，判断所述PCR扩增产物是否含有865bp的特征条带，如果含有，则所述被检测烟草品种具有N基因序列，对TMV具有抗性；反之，则所述被检测烟草品种不具有N基因介导的TMV抗性。
3.根据权利要求2所述的烟草是否具有N基因介导的TMV抗性的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系组成为:2 X Dr eamt aq MIX I Ou I，模板DNA Iu I，上游引物Iu I，下游引物Iul，最后用双蒸水将反应体系补至20ul。
4.根据权利要求3所述 的烟草是否具有N基因介导的TMV抗性的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为:94~95°C预变性3~5min ；94~95°C变性30s ;退火温度 53-570C，30s ;72°C延伸 Imin ;30_35 个循环，最后 72°C，IOmin 停止反应。
5.根据权利要求4所述的烟草是否具有N基因介导的TMV抗性的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为:94°C预变性3min ;94°C变性30s ;退火温度56°C，30s ；72°C延伸Imin ;共35个循环，最后72°C IOmin停止反应。
6.一种检测烟草是否具有N基因介导的TMV抗性的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括:PCR反应试剂和引物；所述引物包括: 上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示； 下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
【文档编号】C12Q1/68GK103866038SQ201410135454
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】张玉, 罗成刚, 杨爱国, 张伟, 蒋彩虹, 常爱霞, 冯全福, 钱玉梅, 程立锐, 耿锐梅, 任民 申请人:中国农业科学院烟草研究所