一种利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的标记引物及方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种利用线粒体D-Ioop区特异区域鉴定電的标记引物及方法。
【背景技术】
[0002] 電(Pelochelys cantorii)是電属仅有的S个种之一，又被称为"水中大熊猫"。電 生活在淡水中，是整科中体型最大的一种。電广泛分布在东南亚各国，中国南部，印度和己 基斯坦的海岸。然而，因为捕猎，栖息地的破坏W及环境的污染，電的分布范围和数量急剧 减少。在1996年，電被列入世界自然保护联盟（IUCN)世界溯危动物红色名录易危种，并在 2000年提升为溯危种。因为電极度溯危的状态，中国也将它列为一级保护动物。
[0003] 電的稀少使得人们缺少对它的了解，形态特征无法单独作为精确判断的标准，鉴 定方法不够准确。電和整在幼体阶段非常相似，野外的个体得不到有效保护。因为没有专业 知识，人们有时会错误的将野外捕到的成電当作野生大整售卖。运种问题进一步加重了電 种质资源的减少，从而影响了保护措施的有效性。
[0004] 线粒体基因组是16-18kb大小的环状DNA，编码13个蛋白，22个tRNA，2个rRNA。线粒 体DNA具有结构简单，高突变率，缺少基因重组W及严格的母性遗传的特性。因为运种特点， 线粒体DNA被广泛的用于物种鉴定，系统进化，种群多样性等方面的研究。
【发明内容】
[0005] 本发明目的之一是提供一种利用线粒体D-Ioop区特异区域鉴定電的标记引物。
[0006] 本发明采用W下技术方案来实现本发明的目的：一种利用线粒体D-Ioop区特异区 域鉴定電的标记引物，为W下引物组： DlF:5 '-ATTAATTCATGCTTGTAGGAC-3 ' D1R:5'-CGGGGTAGGGGGTTTAG-3'。
[0007] 线粒体DNA(mtDNA)控制区，又称D-Ioop区，是一段非编码区，通常位于tRNAPro和 tRNAPhe基因之间。结构较为复杂，分为3个区段:终止序列区、中央保守区和保守序列区。由 于缺乏编码的压力，控制区的进化速度相对较快，其序列的变异不仅有核巧酸之间的替换， 还有不同长度核巧酸序列的缺失、插入或不同拷贝数的串联重复，是线粒体DNA序列和长度 变异最大的区域，常用于种内的遗传多样性，进化分析等。尽管mtDNA变异率高，但也存在一 些保守序列，运些保守序列可W承担标记基因的作用。本发明人采用广东省的高明和肇庆 广宁的死亡的幼電样本提取线粒体DNA与NCBI上厦口電和永嘉電的线粒体DNA对比，发现電 的线粒体DNA控制区存在重复片段的特殊结构，而该特殊结构在目前已知的龟整物种中均 没有发现。可见，线粒体DNA控制区序列在种内几乎是相同的，在种间的差异很大，可用于种 间鉴别。因而，本发明根据所述特殊结构设计特异性引物用来实现对電的鉴定。本发明人还 采用多个電个体进行验证，排除了由于单个个体突变所产生特殊结构的可能性，保证了引 物应用的广泛性和可靠性。发明人针对電的线粒体DNA控制区存在的重复片段设计引物对， 并验证所设及引物的特异性。图1中虚线标注的地方为上游引物的设计位置，实线标注的地 方是下游引物的设计位置，而各引物组扩增的预期片段大小见表1。经过验证，设计的Dl引 物对特异性最强。
[000引本发明的目的之二为提供一种鉴定電的方法。具体为，一种利用线粒体D-Ioop区 特异区域鉴定電的方法，采用上述引物组对待测样本的全基因组DNA进行PCR扩增，然后进 行电泳，如能够获得两条電特异性多态性片段的条带，即判断待测样品的物种是電，反之则 获得相反结果。
[0009]或者，在电泳后，切胶回收電特异性多态性片段进行连接载体测序，所得结果与已 有電线粒体DNA对比，运样就可更加确切地判断待测样品的物种是否是電。
[0010] 本发明所述PCR扩增反应的循环参数为：94°C解链4min，94°C变性30s，59°C退火 30s，72°C 延伸 3〇3,30个循环，72°(：延伸1〇111111。
[0011] 本发明的有益效果是： (1)本发明根据電线粒体DNA控制区存在重复片段的特殊结构设计特异性引物，利用 所设计的特异性引物对待测样本的全基因组DNA进行扩增，根据扩增后的电泳是否出现電 的特异性多态性片段来判断待测样本的物种是否为電。
[0012] (2)本发明利用mtDNA标记，但不需要单独提取mtDNA用于鉴定，只需按常规方法 提取全基因组，利用全基因组中少量的mtDNA即可通过引物通过PCR扩增及电泳后获得鉴定 结果，操作简单，周期时间短，可大批量进行鉴定，一天即可得到鉴定结果。
【附图说明】
[001 ：3 ]图1是不同電的线粒体DNA中控制区的氨基酸序列的比对， 虚线标注的地方是引物Dl和D3上游引物D-Ioop区的设计位;黑线标注的是Dl和D3的下 游引物的设计位置，在序列上有两个结合位置。
[0014] 图2是特异引物筛选扩增片段电泳图， 1为引物Dl扩增结果;2和3为引物D2扩增结果;4为引物D3扩增结果;5为化5000 mark。
[0015] 图3是特异引物扩增片段电泳图， 1-4为广宁電扩增产物;5-8为高明電扩增产物;9为化2000 mark; 10-15为黄喉拟水龟 扩增产物；16-22为中华整扩增产物。
【具体实施方式】
[0016] W下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于W下实施 例。所述技术领域的普通技术人员依据W上本发明公开的内容，均可实现本发明的目的。 [0017]材料和方法 1.1材料 在广东省的高明和肇庆广宁，分别发现有電的活体材料。它们被保护在池塘中进行养 殖，雌電性成熟产卵，已成功解化幼電。实验用的组织取自死亡的幼電样本，用利用组织 E.Z.N.A.? Tissue DNA Kit (Omega Bio-Tek, Guangzhou, Qiina)提取分布两地的電全 基因组DNA，-20度保存备用。
[0018] 提取步骤具体如下： 1)取保存于无水乙醇中的肌肉组织30yg左右，用去离子水洗涂指甲上的酒精，并放在 滤纸上干燥。
[0019] 2)把洗净惊干的组织转入1.5ml离屯、管中，加入20化L Buffer TL,剪碎。
[0020] 3)加入20化OB蛋白酶，混匀，放在摇床中，55°C，180r/min消解1-3 h。
[0021] 4)消化后aooog离屯、5min，吸取上清液，转移至1.5ml离屯、管内，弃沉淀。
[0022] 5)加入220ul Buffer BL，混匀，在70°C水浴锅中放置lOmin，期间混匀2-3次。
[0023] 6)取出后加入220 Ul无水乙醇，混匀。
[0024] 7)将上一步中的混合液转移至套在2ml收集管中化Bind DNA柱中，室溫中SOOOg 离屯、Imin，将DNA结合到滤膜上，弃滤液。 8)将柱子转移到另一组2ml收集管中，加入50化L皿Buffer,室溫SOOOg离屯、Imin, 弃滤液。
[00巧]9)再将柱子转移到另一组2ml收集管中，加入650化用乙醇稀释的DNA Wash Buffer，室溫中SOOOg离屯、Imin，倒掉滤液 10)用同一组收集管重复上述步骤9)。
[00%] 11)将柱子重新放在收集管中，室溫中ISOOOg离屯、3min。
[0027] 12)将柱子装在1.5ml离屯、管上，打开柱子盖子，干燥3min中，加50ul 70°C预热 的无菌水。在室溫下放置3min。室溫下，1000 Og离屯、2min，得到的滤液即为DNA溶液。
[0028] 13)琼脂糖凝胶电泳检巧阳NA的纯度及完整性，NanoQTM微型分光光度计检巧阳NA 浓度，并用去离子水稀释至终浓度20ngAiL，置于-20°C保存备用。
[0029] 特异性引物的设计和筛选 在D-Ioop区存在重复的部分(图1)，根据重复部分设计了 2对引物(表1)。因为存在重复 片段，经过PCR电泳引物扩增结果就会呈现长度多态性。
[0030]
用设计的引物对電的全基因组DNA分别进行PCR扩增，参考预期的多态性片段大小和电 泳结果进行比较，筛选达到预期的引物。
[0031 ] PCR采用20 反应体系，1 的模板DNA (20 ng)，10 的Premix Taq?(Takara Biotechnology, Dalian, Qiina)，0.5 yl 的上下游引物（10 mM)，8 yl 水补至20 yl。 PCR扩增反应的循环参数为:94°C解链4min，94°C变性30s，59°C退火30s，72°C延伸30s，30个 循环，72 °C延伸lOmin。
[0032]电泳结果如图2所示，设计的引物利用電基因组DNA扩增进行初筛，引物D1-3都呈 现了多态性片段。但是D2-3由于特异性不足，除了获得了预期大小的片段，也出现了预期大 小之外的片段。而引物Dl没有杂带，同时得到了预期大小的目的条带，选定作为主要的筛选 引物。
[0033] 引物扩增片段测序验证 将PCR扩增产物利用E. Z. N. A胶回收试剂盒(Omega)纯化回收： (I) 用T肥缓冲液配制1.2%(w/v)的琼脂糖凝胶(含0.5iig/mL DNAgreen)。
[0034] (2)将DNA样品加入点样孔，220V电压，常溫进行电泳13min。
[0035] (3)在紫外灯下观察DNA带迁移位置，当目的带分离清楚时，用干净的刀片切下含 有目的DNA的凝胶，转入1.5mL离屯、管中。
[0036] (4)按照E. Z. N. A胶回收试剂盒操作步骤(Omega)介绍的方法回收纯化PCR产物。
[0037] (5)称取空离屯、管的重量，切下带目的片段的凝胶装在1.5mL离屯、管中并称其重 量，近似地确定其体积。一般情况下，凝胶的密度为Ig/mL，于是凝胶的体积与重量的关系可 按下面换算：凝胶薄片的重量为〇.2g则其体积为0.2mL加入等倍凝胶体积的Binding Buffer,把混合物置于55°C-65°C水浴中溫浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3min混匀一 次。
[0038] (6)转移70化L的DNA-琼脂糖溶液到一个化BindTM DNA柱子，并把柱子装在一个干 淨的2mL收集管内，室溫下，10，000 X g离屯、Imin，弃去液体。
[0039] (7)-个化Bind DNA柱子最多可容纳70化L的溶液，如果DNA-琼脂糖混合物的体积 大于70化L，可先转移70化L溶液至柱子，离屯、完后，将余下的溶液继续加上柱子上。但是每 一个化Bind TM柱子最多可W结合25-3化g DNA。如果预期产量较大，则把样品分别加到合 适数目的柱中。
[0040] (8)将柱子重新套回收集管中，加300化Binding Buffer至HiBind DNA柱子中； 室溫下，10，000 X g离屯、Imin，完全去除滤出液。
[0041 ] (9)将柱子重新套回收集管中，加入700化SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子 中，室溫下，10,OOOXg离屯、Imin,去弃滤出液。
[0042] (10)将柱子重新套回收集管中，重复加入700化SPW Wash buffer至HiBind DNA 柱子中，室溫下，10,OOOXg离屯、Imin，弃去滤出液； (II) 弃去滤出液后，将柱子重新套回收集管中，l〇,〇〇〇Xg离屯、IminW甩干柱基质残 余的液体。
[0043] (12)把柱子装在一个干净的1.5mL离屯、管上，加入30~5化L洗脱液或灭菌水上柱 子膜上，10，000 X g离屯、Imin，离屯、管中的溶液就是纯化的DNA产物，保存于-20°c。
[0044] 将回收的DNA连接到PMD18-T Vector载体中，转化入感受态细胞D册a，37°C培养化 后，挑选阳性克隆检测后进行测序。引物Dl扩增的两片段大小结果分别是107bp和37化P，与 预期结果相同。将测序结果的序列同NCBKNational Center for Biotechnology Inf ormat ion)上已经确定的電的线粒体DNA进行比对，比对结果的相似性为99%，故确定引 物Dl和D3通过PCR扩增得到的DNA片段为電的DNA片段。
[0045] 多个体及阴性对照验证 筛选出引物后，取6个样本采用引物Dl进行PCR扩增，然后电泳，观察筛选的引物是否能 在大量样本中正常作用，判断引物的应用可行性。同时利用中华整，黄喉拟水龟的全基因组 DNA作为阴性对照进行扩增，确定引物是否只在電中出现了长度多态性或者是具有扩增能 力。由图3所示的电泳结果可知，采用本发明提供的引物扩增的電样本可W稳定的出现两条 多态片段，整跑不出完整条带，而黄喉拟水龟只能扩增出一种片段，从而证明本发明的引物 的特异性。
[0046] PCR 采用20 反应体系，1 的模板 DNA (20 ng)，10 的Premix TaqTM (Takara Biotechnology, Dalian, Qiina) ,0.5 yl 的上下游引物（10 mM)，8 yl 水补至 20 111。？〔巧广增反应的循环参数为：94°(：解链4111111，94°(：变性3〇3,59°(：退火3〇3,72°(：延伸 30s，30个循环，72 °C延伸 10 min。
【主权项】
1. 一种利用线粒体D-l00p区特异区域鉴定鼋的标记引物，其特征是，为以下引物组： DIF:5 '-ATTAATTCATGCTTGTAGGAC-3 ' DIR:5'-CGGGGTAGGGGGTTTAG-3'。2. -种利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的方法，其特征是，采用权利要求1所述引 物组对待测样本的全基因组DNA进行PCR扩增，然后进行电泳，如能够获得两条鼋特异性多 态性片段的条带，即判断待测样品的物种是鼋，反之则获得相反结果。3. 权利要求2所述的利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的方法，其特征是，所述PCR 扩增反应的循环参数为：94°C解链4min，94°C变性30 s，59 °C退火30s，72°C延伸30 s，30个循 环，72°C 延伸 lOmin。4. 一种利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的方法，其特征是，采用权利要求1所述引 物组对待测样本的全基因组DNA进行PCR扩增，然后进行电泳，切胶回收鼋特异性多态性片 段进行连接载体测序，所得结果与已有鼋线粒体DNA对比，这样就可更加确切地判断待测样 品的物种是否是鼋。5. 权利要求4所述的利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的方法，其特征是，所述PCR 扩增反应的循环参数为：94°C解链4min，94°C变性30 s，59 °C退火30s，72°C延伸30 s，30个循 环，72°C 延伸 10min。
【专利摘要】本发明提供了一种利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的标记引物，为以下引物组：D1F：5’-ATTAATTCATGCTTGTAGGAC-3’，D1R：5’-CGGGGTAGGGGGTTTAG-3’。本发明还提供了利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的方法，采用所述引物组对待测样本的全基因组DNA进行PCR扩增，然后进行电泳，如能够获得两条鼋特异性多态性片段的条带，即判断待测样品的物种是鼋，反之则获得相反结果。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105713973
【申请号】CN201610170843
【发明人】朱新平, 张新铖, 赵建, 李伟
【申请人】中国水产科学研究院珠江水产研究所