一种针对膨胀污泥中Eikelboom Type 0092型丝状菌群特异性引物和方法
【专利摘要】一种针对膨胀污泥中Eikelboom Type 0092型丝状菌群特异性引物和方法，涉及污水生物处理领域。(1)正向引物(5’?AGTTCAGGCGCTCCGGGA?3’)；反向引物(5’?GGYTACCTTGTTACGACTT?3’)。(2)聚合酶链式反应方法的反应体系：2倍浓度的Taq PreMix试剂10μl；DNA模板0.5?1μl；正向引物和反向引物(浓度为10μm/L)各0.5?1μl；加灭菌水到总体积20μl。按上述引物、反应体系进行(PCR)反应，并将扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中跑胶，得到分离良好的DNA亮条带(图1)。本发明对Eikelboom Type 0092型丝状菌群特异性高，能够更高效地进行PCR试验，方便后续对其菌群进行准确定性和定量分析。
【专利说明】
一种针对膨胀污泥中E ike I boom Type 0092型丝状菌群特异 性引物和方法
技术领域
[00011 本发明涉及污水生物处理领域，提供一种针对膨胀污泥中Eikelboom Type 0092 型丝状菌群特异性引物和方法，与其他引物相比，该引物对Eikelboom Type 0092型丝状菌 群特异性高，能够高效准确地进行Eikelboom Type 0092型丝状菌群的PCR试验，对后续 Eikelboom Type 0092型丝状菌群进行准确定性和定量分析。
【背景技术】
[0002] 目前，活性污泥法污水处理厂及活性污泥法工艺时常发生以Eikelboom Type 0092型丝状菌群引起的污泥膨胀问题。目前对Eikelboom Type 0092型丝状菌群的鉴定通 常采用较早的Eikelboom丝状菌鉴定方法及荧光原位杂交(FISH)技术。随着聚合酶链式反 应(PCR)和实时定量PCR试验技术的发展，给Eikelboom Type 0092型丝状菌群的鉴定及定 量提供了新的技术方法。
[0003] 然而，目前针对Eikelboom Type 0092型丝状菌群进行PCR试验的引物稀少，且现 有引物的特异性不是很高，在进行PCR过程中同时可能扩增大量非目的菌种，对后续的序列 分析及对该菌群准确定量带来不便。
[0004] 因此，目前缺乏针对Eikelboom Type 0092型丝状菌群的特异性引物和方法，对 Eikelboom Type 0092型丝状菌群进行更高效准确的PCR试验分析，以便后续对Eikelboom Type 0092型丝状菌群进行准确定性和定量分析。
【发明内容】
[0005] 针对上述研究的不足之处，本发明提供针对Eikelboom Type 0092型丝状菌群特 异性引物和方法，对Eikelboom Type 0092型丝状菌群特异性高，能够高效地进行 Eikelboom Type 0092型丝状菌群的PCR试验，方便后续对其菌群进行准确定性和定量分 析。
[0006] 1.一种针对膨胀污泥中Eikelboom Type 0092型丝状菌群特异性引物，其特征在 于：
[0007] 正向引物序列为5'-厶61'1^^6606(^〇1^^^-3'；
[0008] 反向引物序列为5'-60￥丁厶〇：11^11^6厶(：1'1'-3'。。
[0009] 2.包含所述引物的试剂盒。
[0010] 3.使用所述引物进行PCR扩增的方法，其特征在于:包括变性、复性和延伸。
[0011] 聚合酶链式反应方法的反应体系：
[0012] 2倍浓度的Taq PreMix试剂10μ1 ;DNA模板0·5-1μ1;浓度为ΙΟμπι/L的正向引物和浓 度为ΙΟμπι/L的反向引物各0.5-1μ1;加灭菌水到总体积20μ1。
[0013] 聚合酶链式反应的反应程序：
[0014] ①1个循环:温度为94°C时间为2-5min。
[0015] ②30个循环：依次为变性温度94°C，时间20-45S;复性温度50-58°C，时间30s-lmin;延伸温度72°C，时间2min。
[0016] ③1个循环:温度72°C，时间5-10min。
[0017] 与现有引物相比，本发明具有以下优点：
[0018] (1)本发明提供的Eikelboom Type 0092型丝状菌群特异性引物和方法能更高效 地进行Eikelboom Type 0092型丝状菌群PCR试验。
[0019] (2)本发明提供的Eikelboom Type 0092型丝状菌群特异性引物可以更准确地进 行后续Eikelboom Type 0092型丝状菌群定性及定量分析。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明文献中Eikelboom Type 0092型丝状菌群基因序列
[0021] 图2为本发明NCBI数据库中搜索的Eikelboom Type 0092型丝状菌基因序列
[0022] 图3为本发明Eikelboom Type 0092型丝状菌群PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳图
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和具体实施方法对本发明作进一步详细说明，本发明提供的 Eikelboom Type 0092型丝状菌群特异性引物和方法包括以下内容：
[0024] (1)在文献和NCBI库里查找Eikelboom Type 0092型丝状菌群序列（图1和图2); [0025] (2)对Eikelboom Type 0092型丝状菌群各序列与其他菌序列进行比对分析，选择 设计其特异性引物的模板序列：X85210.1、AB445103.1、AB445104.1、AB445105.1和 AB445106.1(NCBI 检索号）；
[0026] (3)根据引物设计的一般原则（引物长度、引物GC含量、引物Tm、引物3'端和5'端注 意事项、引物序列与模板序列组成的相似性、AG值等)进行引物的设计，主要进行设计引物 类型、搜索模式、前后引物搜索范围、产物大小、引物长度等参数设置；
[0027] (4)得到前后引物后分析其有无① Hairpin:引物自身是否会形成发夹结构；② Dimer:同一种引物是否会形成二聚体;③False primiring:引物在待扩增序列中其他位置 是否有配对;④Cross Dimer:正向与反向引物间是否会形成二聚体，同时查看引物各指标 是否符合引物设计原则；
[0028] (5)按需要对设计的引物进行结合位点、酶切位点等相应编辑；
[0029] (6)准备200μ1离心管，依次加入2倍浓度的Taq PreMix试剂10yl;DNA模板ΙμL;正 向引物和反向引物（ΙΟμπι/L)各0.5μ1;加灭菌水到总体积20μ1;同时用灭菌水代替DNA模板 进行阴性对照试验。
[0030] (7)对PCR仪设定反应程序:①1个循环:温度为94 °C时间为4min。②30个循环:依次 为变性温度94°C，时间40s;复性温度50°C，时间50s;延伸温度72°C，时间2min。③1个循环： 温度72°C，时间lOmin。
[0031] (8)将PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳试验，观察目的DNA条带的分离效果 良好(图3)，进行下一步。
[0032] (9)将目的条带进行凝胶回收和连接转化后送测序公司测序，将测序序列与目的 菌种的DNA序列对比分析，发现与目的菌群序列一致。
[0033]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种针对膨胀污泥中Eikelboom Type 0092型丝状菌群特异性引物，其特征在于： 正向引物序列为5'-六61'1^^6606(^〇1^^^-3'； 反向引物序列为5'-66丫了厶〇：11^7^06厶(：1'1'-3'。2. 包含如权利要求1所述引物的试剂盒。3. 使用如权利要求1所述引物进行PCR扩增的方法，其特征在于：包括变性、复性和延 伸。4. 如权利要求3所述方法，其特征在于： 聚合酶链式反应方法的反应体系： 2倍浓度的Taq PreMix试剂10yl;DNA模板0.5-1μ1;浓度为ΙΟμπι/L的正向引物和浓度为 ΙΟμπι/L的反向引物各0.5-1μ1;加灭菌水到总体积20μ1。5. 如权利要求3所述方法，其特征在于： 聚合酶链式反应的反应程序： ① 1个循环:温度为94 °C时间为2-5min。 ② 30个循环：依次为变性温度94°C，时间20-45s;复性温度50-58°C，时间30s-lmin;延 伸温度72°C，时间2min。 ③ 1个循环:温度72°C，时间5-10min。
【文档编号】C12N15/11GK106086170SQ201610417829
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日 公开号201610417829.0, CN 106086170 A, CN 106086170A, CN 201610417829, CN-A-106086170, CN106086170 A, CN106086170A, CN201610417829, CN201610417829.0
【发明人】焦二龙, 高春娣, 李任飞, 田烨, 樊士信, 彭永臻
【申请人】北京工业大学