毛酸浆的分子特异性标记引物及鉴别方法与流程

本发明属于利用分子生物学方法鉴别毛酸浆Physalis pubescens L.的技术领域，涉及一种鉴别毛酸浆的特异性标记引物，以及一种利用该特异性引物对毛酸浆进行快速鉴别的方法。

背景技术：

毛酸浆(Physalis pubescens L.)，别名黄菇茑、洋菇娘，是茄科(Solanaceae)酸浆属(Physalis)一年生草本植物。其原产美洲，在我国吉林、黑龙江、辽宁及内蒙东部东南边缘区域有栽培或逸为野生，多生于草地或田边路旁。毛酸浆是一种非常重要的药用食用兼备植物。作为一味民间传统中药，毛酸浆在《神农本草经》中最早收录，并列为中品，其带萼果实或全草称为灯笼草，性味酸平，入肺经，具有清热解毒、利尿止血的功效，可治愈腮腺炎、咽喉肿痛、小便不利及肺热咳嗽，等。除了药用功效外，毛酸浆还被用作高档的新型营养保健“本草水果”，其果实清香可口，味道甜美，果实内含有丰富的维生素C、胡萝卜素、钙、铁等20多种矿物质和18种人体所需要的氨基酸，营养丰富，深受人们喜爱。此外，毛酸浆果实还可加工制成果汁、果脯蜜饯、罐头等，风味独特，成人儿童喜食，老幼咸宜。酸浆属植物(毛酸浆Physalis pubescens、小酸浆P.minima、苦蘵P.angulata及酸浆Physalis alkekengi var.franchetii)的形态学特征极其相似，利用传统分类方法很难将毛酸浆与其他酸浆属相似植物区分开。因此，将其他酸浆属植物误认为毛酸浆进行使用的情况时有发生，这为毛酸浆资源的安全使用和保护带来了很大困难。

DNA分子标记尤其是特异性分子标记技术弥补和克服了传统分类方法的一些缺陷和难题，可以通过基因序列差异比较分析为植物鉴别、系统分类提供直接的证据。本专利首先运用SCoT分子标记技术，采用PCR技术获得酸浆属植物SCoT指纹图谱。经过大量筛选试验，获得毛酸浆特异性条带，通过切胶回收、TA克隆、测序等方法，开发设计了用于毛酸浆快速鉴别的特异性标记引物，为毛酸浆种质资源的准确鉴别及保护提供有效的分子技术依据。迄今为止，尚未有分子特异性标记应用于毛酸浆鉴别的研究报道。

技术实现要素：

本发明第一个目的是针对现有技术的不足，提供毛酸浆的分子特异性标记引物(ST3MSJF/ST3MSJR)，该特异性标记引物序列如下：

上游引物ST3MSJF：5’-ATTGATAGGGTAAACCATG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物ST3MSJR：5’-CTGTAATAAAACAAAAGCG-3’，如SEQ ID NO.2所示。

该引物组合是采用常规PCR技术，经过大量筛选实验，采用SCoT标记获得毛酸浆特异性DNA片段，通过切胶回收、TA克隆、测序，获得该DNA序列，在此基础上设计毛酸浆特异性标记引物，以该引物对酸浆属植物进行PCR扩增，只与毛酸浆样本DNA发生反应，获得1479bp大小的特异性片段，而不与其他酸浆属植物样品反应。运用该特异性引物，通过常规PCR反应即可以快速鉴别出毛酸浆样品。

本发明的第二个目的是提供上述分子特异性标记引物鉴别毛酸浆的方法。该方法为：采用上述引物组合(ST3MSJF/ST3MSJR)作为特异性扩增引物，以待测酸浆属植物基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现分子量为1479bp大小的特异性片段，则待测酸浆属植物样品为毛酸浆，反之则不是。

具体的本发明所述方法如下：

(1)基因组DNA的提取：剪取待测酸浆属植物样品新鲜叶片100mg放入研钵，立即加入液氮研磨至粉末，然后使用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(购于上海生工生物工程有限公司)提取基因组DNA，所得DNA用0.8％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μl。

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物(ST3MSJF/ST3MSJR)作为扩增引物，进行PCR扩增。

PCR扩增体系(总体积20μl)：2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂(25mM)，0.8μl dNTPs(10mM)，1μl引物ST3MSJF(10μM)，1μl引物ST3MSJR(10μM)，1μl模板DNA(50ng/μl)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，11.7μl ddH₂O。

PCR反应程序：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

(3)利用1.5﹪琼脂糖凝胶对步骤(2)PCR产物进行电泳检测，经凝胶成像系统拍照检测，若电泳结果出现分子量为1479bp大小的DNA条带，则待测样品为毛酸浆，反之则不是。

本发明实验样品用量少；结果准确、灵敏度高，ST3MSJF/ST3MSJR为毛酸浆专一性扩增引物，若为其他酸浆属植物样品，为阴性反应；方法简便，采用常规PCR技术进行检测，耗时短，半日即可完成。

附图说明

图1是利用本发明设计的特异性标记引物ST3MSJF/ST3MSJR对酸浆属植物样品进行PCR扩增后的电泳图，其中M为DNA分子量标准marker DL2000；通道1～4：小酸浆P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸浆P.alkekengi var.franchetii；18～20：毛酸浆P.pubescens。电泳图显示只有毛酸浆样品扩增出分子量为1479bp大小的特异性DNA条带。

具体实施方式

本发明可以从分子水平上较为快速准确的鉴别毛酸浆样品，通过以下实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：毛酸浆分子特异性标记引物开发设计

1.基因组DNA的提取

剪取酸浆属植物样品新鲜叶片100mg放入研钵，其中样品包括小酸浆(采自1：河北唐山、2：山东菏泽、3：安徽六安、4：浙江丽水)、苦蘵(5-6：浙江杭州、7：湖北黄冈、8：云南红河、9：江苏南京、10：浙江台州、11：浙江温州、12：浙江金华、13：山东德州)、酸浆(14：辽宁沈阳、15-16：辽宁丹东、17：山东济南)及毛酸浆(18：辽宁沈阳、19：黑龙江肇东、20：吉林长春)。立即加入液氮研磨至粉末，然后使用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(购于上海生工生物工程有限公司)提取基因组DNA，所得DNA用0.8％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μl。用于后续PCR扩增。

2.设计分子特异性标记引物

经过大量SCoT-PCR扩增筛选实验，通过切胶回收、TA克隆、以及测序获得毛酸浆特异性核苷酸序列，在此基础上设计获得ST3MSJF/ST3MSJR引物序列(ST3MSJF：5’-ATTGATAGGGTAAACCATG-3’；ST3MSJR：5’-CTGTAATAAAACAAAAGCG-3’)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

实施例2：分子特异性标记引物PCR扩增及电泳检测

用设计合成的引物ST3MSJF/ST3MSJR对不同酸浆属植物样品(具体见附图说明)进行PCR检测。

PCR反应体系(总体积20μl)：2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂(25mM)，0.8μl dNTPs(10mM)，1μl引物ST3MSJF(10μM)，1μl引物ST3MSJR(10μM)，1μl模板DNA(50ng/μl)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，11.7μl ddH₂O。

PCR反应程序：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

利用1.5﹪琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，电泳图如图1所示，从图1(图中，通道M为DNA分子量标准marker DL2000；通道1～4：小酸浆P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸浆P.alkekengi var.franchetii；18～20：毛酸浆P.pubescens)可以看出，只有毛酸浆(通道18～20)能扩增出特异性片段，将毛酸浆的特异性片段送去测序，其序列长度为1479bp。而其他酸浆属植物样品没有扩增出任何条带，这表明本发明的特异性引物具有极高的专一性，因此可以用于毛酸浆样品的快速鉴别。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州师范大学

<120> 毛酸浆的分子特异性标记引物及鉴别方法

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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