一种用于检测金锈菌的特异性引物、试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种用于检测金锈菌的特异性引物及检测方 法。
【背景技术】
[0002] 金锈菌属（ChrysomyxaUnger)真菌主要侵染云杉属（Picea)、铁杉属（Tsuga)和油 杉属（Keteleeria)等松科植物，造成针叶、球果和顶芽被害，引起云杉叶锈病、云杉球果锈 病和云杉芽锈病等严重病害。广泛分布于我国四川、甘肃、陕西、新疆、东北和青海等地，造 成云杉林衰退，威胁云杉天然及人工林的安全，造成巨大的经济损失。在2013年1月国家林 业局公布的最新"全国林业危险性有害生物名单"中，36种重要林木病原真菌中包括了引起 云杉叶锈病和球果锈病的三种重要的金锈菌：云杉锈病菌（Chrysomyxadeformans (Diet.) Jacz·，青海云杉叶锈病菌（ChrysomyxaqilianensisWang.Wu et Li)和红皮云杉叶锈病菌 (ChrysomyxarhododendriDe Bary)。近年来，云杉叶锈病在大、小兴安岭林区的红皮云杉 人工幼林及林间苗圃的苗木上危害严重。伊春林区的幼壮林发病面积达3. 6万hm2,平均 发病率49. 3%，病情指数30. 3 ;苗圃2-4年生幼苗发病5. 5万hm2,发病率93. 7%。仅甘肃 天祝县天然林发病面积已达2. 8万hm2,严重受害面积占总面积43. 1 %，材积生长损失平均 每年20%左右。同样，在甘肃，云杉球果锈病造成的球果平均被害率达69. 1%，最高可达 100%。由此可见，金锈菌引起的锈病已成为云杉林主要病害之一，而云杉林作为我国天然 林的重要建群树种以及生态林的重要造林树种，在生态环境建设和木材生产中占有举足轻 重的位置。对于云杉锈病的防治已成为我国森林病害防治的重要环节。此外，大多数金锈 菌转主寄生在杜鹃科（Ericaceae)、鹿蹄草科（Pyrola)等被子植物上，引起转主寄主锈病， 而杜鹃、鹿蹄草等作为云杉林的活植被，通过清除这些转主寄主来防治云杉锈病，是不可能 的。因此，为防治云杉锈病带来更大难题。
[0003] 此外，由于金锈菌的寄主范围非常广泛，且在各种云杉以及中间寄主上产生的症 状极为相识，依据目前传统的形态分类学方法不能清楚地展现金锈菌属生物之间的系统关 系，从而对于金锈菌所致病害的检测和控制缺少有效技术依据，这也是生产中预警和治理 这类病害的难点所在。因此，对云杉锈病病原菌进行早期检测，并采取相应措施防治病害发 生，对于病害的控制至关重要。但是，常规的病害诊断技术难以快速准确地对该病害的病原 菌作出鉴定。所以，建立金锈菌的检测技术，尤其是早期快速检测技术尤为重要和迫切。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于金锈菌检测的特异性引物，采用该引物能对金锈 菌进行早期检测，检测特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠。
[0005] 为达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
[0006] 1、提供一种用于金锈菌检测的特异性引物。
[0007] 2、提供一种检测金锈菌的方法。
[0008] 3、提供一种用于检测金锈菌的试剂盒。
[0009] 为实现本发明的一个目的，本发明通过分析金锈菌rDNA的ITS序列的基础上，设 计了特异性引物，所述的特异性引物由正向引物α和反向引物β组成，其核苷酸序列如序 列表 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
[0010] 正向引物 α 的核苷酸序列（SEQ ID No. 1)为：CCTGCGGAAGGATCATTAT ;
[0011] 反向引物 β 的核苷酸序列为（SEQ ID No. 2)为：TAAGTTCAGCGGGTAGTCCC。
[0012] 为实现本发明的另一目的，本发明提供的一种检测金锈病菌的方法，使用正向引 物α和反向引物β对金锈病菌进行检测，包括：
[0013] 提取待测菌株的DNA ;
[0014] 以所述待测菌株的DNA为模板，采用所述特异性引物进行PCR反应，得到PCR扩增 产物；
[0015] 将得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，得到电泳图；
[0016] 根据电泳图，观察所述待测菌株是否在580_590bp出现单一电泳条带，从而分析 判断所述待测菌株是否属于金锈菌。
[0017] 其中，所述PCR反应的扩增体系为25 μ L，反应体系为： 2XEsTaqMasterMixl2.5yL，待测菌株基因组 DNA lyL，2.5yM/L 引物各 2.5yL，CldH2O 6. 5 μ L0
[0018] 其中，所述PCR反应的扩增是94°C预变性3min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C 延伸lminlOs，3〇-35个循环，最后72°C再延伸lOmin。
[0019] 特别是，所述凝胶电泳检测中使用的琼脂糖凝胶浓度为1-1. 5% g/mL，琼脂糖凝 胶电泳的电压为4_6V/cm。
[0020] 优选地，所述凝胶电泳检测中使用的琼脂糖凝胶浓度为1. 1-1. 4% g/mL，琼脂糖 凝胶电泳的电压为5V/cm。
[0021] 为实现本发明的再一目的，本发明提供一种用于检测金锈病菌的试剂盒，所述试 剂盒中包括上述特异性引物，还包括：
[0022] 用于提取菌株DNA的提取液和提取方法；
[0023] 用于进行PCR反应的试剂盒；
[0024] 用于检测PCR产物的琼脂糖凝胶和方法。
[0025] 其中，所述PCR反应试剂盒可以从商业途径购买，也可以自己配置。
[0026] 其中，所述 DNA 提取液包括：10mM Tris-HC1(PH 8.3)，1.5mM MgCl2,50mMKCl， 0· 01 % Proteinase K 和 0· 01 % SDS
[0027] 其中，所述DNA的提取方法包括：在解剖镜下挑取云杉针叶上单个锈孢子堆里的 100-200个锈孢子，放置在一片已灭过菌的载玻片上，并将锈孢子的集中区域标记为"0"形 区，轻轻覆盖另一片已灭菌的载玻片使用研磨棒压着锈孢子的"0"区域的同时，来回搓动 两片载玻片，利用两片载玻片的摩擦力进行研磨处理，使其充分破壁，在光学显微镜下观察 有浆状物出现即可，然后小心分开载玻片，用移液器取提前解冻的20uL DNA提取液（IOmM Tris-HCl (PH 8. 3)，I. 5mM MgC12, 50mMKCl, 0· 01% Proteinase K, 0· 01% SDS)反复洗涤载 玻片的"0"区域，目的为将破壁后的锈孢子尽可能多的洗脱下来，将洗涤液回置于PCR管内 壁中。于37°C水浴1个小时，95°C预变性10min。DNA提取物于-20°C保存备用
[0028] 其中，所述试剂盒中包括由2XEs TaqMasterMix 12. 5 μ L，2. 5 μ M/L引物各 2. 5 μ L，ddH20 6. 5 μ L组成的反应体系。
[0029] 特别是，所述使用试剂盒进行PCR反应的反应条件是：94°C预变性3min，94°C变性 3〇8,55°0退火3〇8,72°0延伸1111丨111〇8,3〇-35个循环，最后72°0再延伸1〇11^11。
[0030] 特别是，所述琼脂糖凝胶的浓度为1-1. 5% g/mL，优选为1. 1-1. 4% g/mL。
[0031] 特别是，使用琼脂糖凝胶用于检测PCR产物的方法中，琼脂糖凝胶电泳的电压为 4_6V/cm，优选为 5V/cm。
[0032] 有益效果：
[0033] 1、本发明利用生物信息和生物学方法，提供一种检测金锈菌的特异性引物，能准 确的从多种锈菌菌株中识别金锈菌菌株，通过本发明提供的特异性引物扩增得到的金锈菌 条带清晰，无杂带，可见本发明提供的引物特异性好，可对金锈菌菌株进行准确地诊断和检 测。
[0034] 2、本发明提供的检测方法，准确性高、灵敏度高，可快速准确简单地判断样品中是 否存在金锈菌，为云杉锈病的早期监测提供有效手段。
[0035] 3、利用本发明提供的试剂盒，能快速、准确、简便地从云杉针叶（芽或球果）中检 测出病原菌，可实现对病原菌进行早期检测。成本低，检测方便，检测效果显著，在生产上有 广泛的应用价值。
【附图说明】
[0036] 图1本发明实施例中特异性检测的凝胶电泳结果图；
[0037] 图2本发明实施例中灵敏度检测的凝胶电泳结果图；
[0038] 图3本发明试验例中样品检测的凝胶电泳结果图。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案