紫苑石斛的分子特异性标记引物及检测方法
【专利摘要】本发明涉及紫苑石斛的分子特异性标记引物，以及一种能对紫苑石斛进行快速鉴定的方法。所述引物序列为：上游引物：5′?AGCGGCCGCGCCTTCC?3′；下游引物：5′?GGAAGGCGCGGCCGCT?3′。本发明有益效果主要体现在：本发明分子特异性标记引物可对紫苑石斛进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别石斛品种所不能替代的分子手段。
【专利说明】
紫苑石斛的分子特异性标记引物及检测方法 (一)
技术领域
[0001] 本发明涉及紫苑石斛的分子特异性标记引物，以及利用该引物对紫苑石斛进行鉴 别和检测的方法。 (二)
【背景技术】
[0002] 石斛(D. orchids )，又名石斛兰，是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)植物， 广泛分布于亚州和大洋州的中国、日本、菲律宾、泰国、印度、马来西亚、澳大利亚和新西兰 等国，约有1000多个种，我国有74种和2个变种。石斛作为一种优良的药用植物，具有较高的 药用及保健价值，最早见于《山海经》，药用始载于《神农本草经》，其后被《本草纲目》等历代 本草录述，具有"主伤和，除痹，下气，补五藏虚劳赢瘦，强阴，厚肠胃，轻身，延年"等功效。
[0003] 药用植物种质资源是中药生产的源头，是进行中药材品种改良、新品种培育及遗 传工程的物质基础，尤其是野生近缘植物和古老的地方种是长期自然选择和人工选择的产 物，具有独特的优良性状和抵御自然灾害的特性。随着石斛的传统功效不断被人们通过现 代药理研究和临床疗效所肯定，石斛产品越来越受到消费者推崇，以石斛为原料的药品和 保健品也逐步开发并进入市场，据浙江省中药材产业协会铁皮石斛分会统计，2013年全省 石斛相关产业总产值达30亿元，2015年达到40亿元。为保障石斛产业又好又快发展，要充分 认识石斛品种对发展石斛产业的重要性，必须加快石斛优良种苗发展和强化质量管理。对 石斛种苗质量的监督管理要着力解决目前生产上石斛种苗的混乱局面，并首先从技术层面 上对石斛品种进行鉴别保护。
[0004] 对石斛品种的鉴别主要依据表观特征，但由于许多形态性状鉴定的周期长、受环 境影响大，并且品种数量不断增多，使得品种鉴定愈来愈困难。自本世纪以来，一些基于PCR 的分子标记技术如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、ISSR (Inter-Simple Sequence Repea，简单序列重复区间扩增多态性）和SRAP( sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性) 相继用于石斛的种质资源遗传 多样性、遗传距离研究，但对于分子标记与石斛性状的连锁、石斛品种间的分子鉴别研究很 少，况且这些分子标记所采用的或为通用随机引物或为成套设计引物的随机组合，其PCR扩 增图谱不仅复杂、重复性差，而且特异性不高，因此并不适合用于品种鉴定。SCAR(Se qUenCe Characterized Ampl if ied Region，特征性片段扩增区域）标记是1993年由Paran和 Michelmore在RAPD基础上提出的，它基于对特异RAH)片段的测序，根据两端序列设计一对 18~24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的采用排除 了随机引物结合位点之间的竞争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、 简便、低成本的特点，迄今为止，尚未有SCAR标记应用于石斛品种鉴别的研究报道。 (三)
【发明内容】
[0005] 本发明目的提供紫苑石斛(Dendrobium transparens)的分子特异性标记引物，以 及一种能对紫苑石斛进行快速鉴定的方法。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 紫苑石斛的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：
[0008] 上游引物：5' -AGCGGCCGCGCCTTCC-3'
[0009] 下游引物:5' -GGAAGGCGCGGCCGCT-3'。
[0010] 该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，获得紫苑石斛的特异性DNA片段，将 该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础，所设计的特异性引物，以该引物对紫苑石斛进 行PCR扩增，可获得lOOObp多大小的特异性片段。
[0011] 本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对紫苑石斛进行快速鉴定的 方法，所述方法为:提取待测石斛品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记 引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果仅出现约lOOObp 大小的特异DNA条带，则待测石斛品种为紫苑石斛，反之则否;所述分子特异性标记引物序 列为：
[0012] 上游引物：57 -AGCGGCCGCGCCTTCC-3'
[0013] 下游引物:5' -GGAAGGCGCGGCCGCT-3'。
[0014] 所述方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及 电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。
[0015] 本发明所述PCR反应体系组成如下：
[0016] Master Mix PCR Buffer 终浓度为IX
[0017] 上、下游引物 各0.4μΜ
[0018] 模板 DNA 60ng
[0019] 余量为 ddH20;
[0020] Master Mix PCR Buffer终浓度为IX，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的 浓度与1XPCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/2的2XMaster Mix PCR BufferjXMaster Mix PCR Buffer试剂选用Biotekecorporation(PR1702)。
[0021] 所述PCR扩增条件如下：95°C预变性4min; 95°C变性lmin，60 °C退火30s，72 °C延伸 lmin，共35个循环;最后于72°C补平5min，终止温度为4°C。
[0022] 具体的，所述方法如下：
[0023] (1)取待测石斛叶片，加液氮彻底磨碎，以SDS-CTAB法提取待测石斛叶片的基因组 DNA；
[0024] (2)以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引 物，进行PCR扩增：
[0025] PCR反应体系每25μ1组成如下：
[0026] 2XMaster Mix PCR Buffer 12.5μ1
[0027] 10μΜ上、下游引物 各ΙμL
[0028] 20ngAU 模板 DNA 3μ1
[0029] ddH20 补足至 25μ1;
[0030] PCR反应条件如下：
[0031] 95°C预变性4min;95°C变性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环；最后 于72°C补平5min，终止温度为4°C ;
[0032] (3)取步骤(2)扩增产物5μ1，与ΙμL 0.25 %溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5 %的琼 脂糖凝胶上，于1 X TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，EB染色通常在含 0.5μg/mlEB的水溶液中染色30分钟后，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现 1 OOObp的DNA条带，则待测样品为紫苑石斛。
[0033] 本发明有益效果主要体现在:本发明分子特异性标记引物可对紫苑石斛进行快速 的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别石斛品种所不能替代的分子手段。 (四）
【附图说明】
[0034]图1为对石斛品种进行PCR扩增的结果;Μ为DNA分子量标准;箭头所指为从编号为 16的石斛品种扩增出的分子量为lOOObp多大小的特殊DNA条带;其余编号为其它的石斛品 种。 (五)
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0036] 实施例1:
[0037] (1)石斛品种基因组DNA的提取：取待测石斛品种幼嫩叶片O.Olg，加液氮彻底磨 碎，基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，经多次抽提，来提取获得石斛的基因组DNA粗提物。 DNA粗提物再经Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化(博日Bioer，杭州，中国）后，通过1.5%的 琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(GeneQuant Pro，GE Healthcare)来检测完整 性、纯度及浓度。0D26Q/0D28Q>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20 °C冰箱贮藏 备用。
[0038] (2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：57 -AGCGGCCGCGCCTTCC-3'和下游引 物5' -GGAAGGCGCGGCCGCT-3'，由杭州擎科工程技术有限公司合成。
[0039] (3) SCAR分子标记的PCR扩增：
[0040] PCR反应体系每25μ1组成如下：
[0041 ] 2XMaster Mix PCR Buffer 12.5μ1
[0042] lOmM特异引物对各ΙμL
[0043] 20ngAU模板DNA 3μ1
[0044] ddH20 补足至 25μ1。
[0045] 扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。PCR扩增条件如下:95°C预变性4min;95°C变性 lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环;最后于72°C补平5min，终止温度为4°C。
[0046] (4)电泳检测:取步骤(3)PCR扩增产物5ul，与lul 0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样 于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1XTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5yg/ mlEB的水溶液中染色30分钟，然后在培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。
[0047] 按照上述方法，（编号1~19代表石斛品种依次为：1 :长苏石斛（Dendrobium brymerianum Rchb · f ·); 2:翅萼石斛（Dendrobium cariniferumRchb · f ·); 3 :鼓植石斛 (Dendrobium chrysotoxum Lindl ·) ;4:晶帽石角斗（Dendrobium crystal linum Rchb.f.)； 5:齿辦石斛；6:串珠石斛（Dendrobium devonianum Paxt ·); 7 :尖刀唇石斛（Dendrobium heterocarpum Lindl.);8:喇队唇石斛（Dendrobium lituiflorum Lindl.);9:杓唇石斛 (Dendrobium moschatum(Buch.-Ham. )Sw.); 10:束花石角斗（Dendrobium chrysanthum Lindl.);ll:肿节石斛（Dendrobium pendulum Roxb · ) ; 12 :报春石斛（Dendrobium primulinum Lindl.);13:梳唇石角斗（Dendrobium strongylanthum Rchb.f.);14:球花石角斗 (Dendrobium thyrsiflorum Rchb.f.); 15:长距石角斗（Dendrobium longicornu Lindl.)； 16:紫毙石斛(Dendrobium transparens); 17:假竹（购自云南德宏热带农业科学研究所）； 18:金钦石角斗(Dendrobium nobileLindl); 19:黑毛石角斗(Dendrobium williamsonii Day et Rchb.f.))进行检测，电泳结果见图1。
[0048]其中编号为16的紫苑石斛，扩增出了分子量为lOOObp多大小的特殊DNA条带，其余 编号为其他石斛品种，未见有l〇〇〇bp多大小的特殊DNA条带产生，可见本发明特异性引物特 异性好、灵敏度高，可用于快速鉴别紫苑石斛。
【主权项】
1. 紫苑石斛的分子特异性标记引物，所述引物序列如下： 上游引物:5' -AGCGGCCGCGCCTTCC-3' 下游引物:5' -GGAAGGCGCGGCCGCT-3'。2. -种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对紫苑石斛进行快速鉴定的方法， 所述方法为:提取待测石斛品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作 为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现lOOObp的特异DNA条 带，则待测石斛品种为紫苑石斛，反之则否;所述分子特异性标记引物序列为： 上游引物:5' -AGCGGCCGCGCCTTCC-3' 下游引物:5' -GGAAGGCGCGGCCGCT-3'。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下:95°C预变性4min; 95°C 变性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环；最后于72°C补平5min，终止温度为4 Γ。4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： (1) 取待测石斛叶片，加液氮彻底磨碎，以SDS-CTAB法提取待测石斛叶片的基因组DNA; (2) 以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进 行PCR扩增： PCR反应体系每25μ1组成如下： 2XMaster Mix PCR Buffer 12.5μ1 ΙΟμΜ上、下游引物 各ΙμL 20ngAU 模板 DNA 3μ1 ddH20 补足至 25μ1; PCR反应条件如下： 95°C预变性4min;95°C变性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环；最后于72 °C补平5min，终止温度为4°C ; (3) 取步骤(2)扩增产物5μ1，与ΙμL 0.25 %溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5 %的琼脂糖 凝胶上，于1 X ΤΑΕ缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后ΕΒ染色，ΕΒ染色通常在含0.5yg/ mlEB的水溶液中染色30分钟后，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现lOOObp的 DNA条带，则待测样品为紫苑石斛。
【文档编号】C12Q1/68GK106086015SQ201610653876
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月10日 公开号201610653876.5, CN 106086015 A, CN 106086015A, CN 201610653876, CN-A-106086015, CN106086015 A, CN106086015A, CN201610653876, CN201610653876.5
【发明人】童晓青, 王丽玲, 秦川, 王衍彬, 刘本同, 黄旭波, 方茹, 钱华
【申请人】浙江省林业科学研究院