一种用于dgge鉴定混合中药粉末组成物种的引物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于DNA条形码结合DGGE分析方法鉴定中药混合物物种组成的引物。所述引物的正向引物为：GCtrnL_F(5`?CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCGAAATCGGTAGACGCTACG?3`)；反向引物为：trnL_R(5`?CCATTGAGTCTCTGCACCTATC?3`)。该引物能有效针对性地引导植物中药粉末混合物中物种DNA的PCR扩增。该引物是根据高等植物的叶绿体基因片段trnL的序列碱基存在差异的特点而设计。可扩增出长度为290bp左右，特异性高的目的片段，通过DGGE分析PCR扩增产物可提供中药混合粉末多组份的物种信息。
【专利说明】
一种用于DGGE鉴定混合中药粉末组成物种的引物
技术领域
[0001]本发明涉及一种用于DNA条形码结合DGGE分析方法鉴定中药混合物物种组成的引物。
【背景技术】
[0002]DGGE技术是一种基因突变检测手段，系通过变性梯度凝胶电泳来分离鉴别基因突变，理想的实验条件可以鉴别出DNA片段中单个碱基突变。DGGE的技术原理是基于在变性梯度凝胶中DNA的解链行为差异导致DNA的迀移速度差异，从而达到分离野生型与突变型DNA片段的目的。利用微生物通用的16S rRNA作为标记物，DGGE技术常被用于检测微环境生物样品中的微生物多样性，分离结果以凝胶上的电泳条带呈现，非常直观，可以达到初步的定性和定量目的。DGGE分析被广泛地应用于土壤、沿海环礁湖表层沉积物、牛奶、人类口腔、肠道(或肠容物)等微环境中的微生物多样性分析中。而DGGE技术中，样品的基因组DNA的PCR成功扩增是重要的环节，而对于引物的设计更关键的一步。目前尚未有将DGGE技术应用于中药粉末混合物鉴定的报道，也未有关于中药粉末混合物DGGE分析的合适标记物。
【发明内容】
[0003]本发明公开了一种引物，能有效针对性地引导植物中药粉末混合物中物种DNA的P C R扩增。所述引物的正向引物为:G C t r n L _ F ( 5 ' -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCGAAATCGGTAGACGCTACG-3');反向引物为:trnL_R(5'-CCATTGAGTCTCTGCACCTATC-3')。
[0004]该引物应用于DGGE技术鉴定中药混合物组成物种方法中样品基因组DNA的PCR扩增中。该引物是根据高等植物的叶绿体基因片段trnL的序列碱基存在差异的特点而设计。可扩增出长度为290bp左右，特异性高的目的片段，通过DGGE分析PCR扩增产物可获得清晰度、分离度较高符合要求的分离条带，提供样品中中药混合粉末组成的物种信息。
【附图说明】
[0005]图1是实施例1样品的PCR产物电泳图；
[0006]图2是实施例1样品的DGGE分析结果图；
[0007]图3是实施例2样品的PCR产物电泳图；
[0008]图4是实施例2样品的DGGE分析结果图；
【具体实施方式】
[0009]下面通过具体的实施例对本发明做进一步说明。
[0010]实施例1:玉屏风散的中药组分物种鉴定分析。
[0011]1、选取并制备样品
[0012]以玉屏风散(药物组成:黄芪、防风、白术)为例，每味药材单独粉碎成细粉，等重混合均匀，作为实验样品。[0〇13 ]2、基因组DNA的提取(改良CTAB法)[0〇14]称取样品lOOmg，置于2.0mL离心管中，加入2颗①5mm的灭菌钢珠，用生物样品均质仪以6.0m/s震荡30s，重复震荡2次，每次间隔30s。向离心管中加入lOOOyL CTAB free缓冲液(1001^1^18-?:1，20111]\1￡01厶，1.4]\1他(:1)，剧烈震荡，旋转混匀5111111，1，3000印111离心 3min，弃上清液；重复该步骤1-2次。向离心管中加入800yL CTAB缓冲液(3%CTAB，1OOmMTri s-HC1，20mM EDTA，1.4M NaC 1)，充分震荡混匀，65 °C金属浴中孵育3h，期间每隔 lOmin左右颠倒混勾数下。加入600此氯仿-异戊醇(24:1，v: v)，充分震荡混勾，静置5min，1， 3000rpm离心15min，小心吸取上清于新的1.5mL离心管中。加入等体积-20°C预冷的异丙醇，-20°C放置10min，l，3000rpm离心15min，弃上清。加800yL-20°C预冷的75%乙醇，上下颠倒混勾数次，1，3000rpm离心15min，重复1次。弃尽上清，打开离心管盖子室温瞭干5min，加入50此65°C预热的ddH20,小心吹打沉淀，将可溶部分转移至新的离心管中，即得样品的基因组DNA。
[0015]3、PCR 扩增
[0016]p C R 体系:T a q D N A 酶预混溶液 1 2 ? 5 y L，引物 G C t r n L _ F ( 5 ' -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCGAAATCGGTAGACGCTACG-3')和反向引物: trnL_R( 5' -CCATTGAGTCTCTGCACCTATC-3')各 1 ? OyL，步骤2所得的基因组DNA 2 ? OyL，ddH20 补足体积至25 ? OyL。反应程序:95°C，2min; 95°C，30s，50°C，30s，72°C，50s，40个循环;72°C， 5min〇[〇〇17]用2%琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(290bp左右)出现清晰条带为阳性。结果如图1所示。
[0018]4、DGGE 分析[〇〇19]将上述PCR产物用于DGGE分析，所用仪器为DCode基因突变检测系统。分析所用的凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，含有尿素和甲酰胺为变性剂，凝胶浓度为10%，变性剂的浓度范围为30 % -60 %。电泳条件为80V，60 °C下电泳12h。电泳结束后，将凝胶置于400mL 0.5yg/mL的溴化乙锭溶液中染色25min。取出凝胶，置于凝胶成像仪中做成像检测。结果如图2所示。
[0020]6、DNA凝胶回收
[0021]用解剖刀将上述凝胶中每个独立的条带切出来，称重，置于1.5mL离心管中。按所切出的凝胶重量的3倍体积加入Binding Buffer，55°C孵育5min，期间每隔lmin取出离心管并颠倒数次。加入5yL Silica Powder Suspens1n，混勾后55°C孵育5min，期间每隔lmin取出离心管并颠倒数次。1，3000rpm离心30s，小心弃去上清。加入500iiL Washing Buffer，震荡使沉淀重新混悬，1，3000rpm离心30s，小心弃去上清，重复洗涤一次。快速离心5s，用移液枪吸走残留液体，室温晾干l〇_15min。加入50此ddH20,震荡使沉淀重新混悬，室温孵育 5min，1，3000rpm离心30s，吸取上清，即得DNA回收液。
[0022]7、第二轮PCR扩增
[0023]PCR 体系:2XP〇wer Taq PCR MasterMixl2.5yL，用本发明引物各 1.0yL，DNA 模板2? OyL，ddH20补足体积至25 ? OyL。温度程序:94°C，2min; 94°C，30s，50°C，30s，72°C，50s，40 个循环;72°C，5min。[〇〇24]用2%琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(250bp左右)出现清晰条带为阳性。
[0025]8、测序和数据分析
[0026]将上述第二轮的阳性PCR产物送检测序。测序得到的数据经过序列拼接、裁切，得到trnL片段约250bp。将该片段提交至基因库(Genbank)与中药材DNA条形码鉴定系统，与公共数据库中的数据做序列比对，进而得出物种鉴定结果。序列比对结果物种相似度为100%。
[0027]实施例2:北沙参、人参、三七和桔梗混合中药粉末鉴定
[0028]I选取并制备样品
[0029]以北沙参、人参、三七、桔梗为例，每味药材单独粉碎成细粉，等重混合均匀，作为实验样品。
[0030 ] 2、基因组DNA的提取(改良CTAB法)
[0031 ] 称取样品10mg，置于2.0mL离心管中，加入2颗Φ 5mm的灭菌钢珠，用生物样品均质仪以6.0m/s震荡30s，重复震荡2次，每次间隔30s。向离心管中加入100yL CTAB free缓冲液(10mMTris-HCl，20mM EDTA，1.4Μ NaCl)，剧烈震荡，旋转混匀5min，I，3000rpm离心3min，弃上清液；重复该步骤1-2次。向离心管中加入800yL CTAB缓冲液(3 % CTAB，10mMTri s-HCI，20mM EDTA，1.4M NaCI )，充分震荡混匀，65 °C金属浴中孵育3h，期间每隔1min左右颠倒混勾数下。加入600yL氯仿-异戊醇(24:1，v: V)，充分震荡混勾，静置5min，I，3000rpm离心15min，小心吸取上清于新的1.5mL离心管中。加入等体积_20 °C预冷的异丙醇，-20°C放置10min，l，3000rpm离心15min，弃上清。加800yL-20°C预冷的75%乙醇，上下颠倒混勾数次，I，3000印111离心151]1；[11，重复1次。弃尽上清，打开离心管盖子室温瞭干51]1；[11，加A50yL 65°C预热的ddH20，小心吹打沉淀，将可溶部分转移至新的离心管中，即得样品的基因组DNA。
[0032]3、PCR 扩增
[0033]P C R 体系:T a q D N A 酶预混溶液 I 2.5 μ L，引物 G C t r n L _ F ( 5 ' -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCGAAATCGGTAGACGCTACG-3')和反向引物:trnL_R(5'-CCATTGAGTCTCTGCACCTATC-3')各I.0yL，步骤2所得的基因组DNA 2.0yL,ddH20补足体积至25.0yL。反应程序:95°C，2min; 95°C，30s，50°C，30s，72°C，50s，40个循环;72°C，5min0
[0034]用2%琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(290bp左右)出现清晰条带为阳性。结果如图3所示。
[0035]4、DGGE 分析
[0036]将上述PCR产物用于DGGE分析，所用仪器为DCode基因突变检测系统。分析所用的凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，含有尿素和甲酰胺为变性剂，凝胶浓度为10%，变性剂的浓度范围为30 % -50 %。电泳条件为80V，60 °C下电泳12h。电泳结束后，将凝胶置于400mL 0.5yg/mL的溴化乙锭溶液中染色25min。取出凝胶，置于凝胶成像仪中做成像检测。结果如图4所示。
[0037]经DNA凝胶回收处理，第二轮PCR扩增，所得阳性PCR产物送检测序，比对序列比对结果物种相似度为100%。
【主权项】
1.一种用于DGGE技术鉴定混合中药粉末组成物种的引物，所述引物用于该类方法中样 品基因组D N A的P C R扩增中，所述引物的正向引物为:G C t r n L _ F ( 5 ' -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCGAAATCGGTAGACGCTACG-3');反向引物为: trnL_R(5'-CCATTGAGTCTCTGCACCTATC-3')〇
【文档编号】C12N15/11GK106086227SQ201610735805
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月26日
【发明人】郑夏生, 陈士林, 成金乐, 赖智填
【申请人】中山市中智药业集团有限公司