GmEF1?α2基因片段作为秦艽根在不同诱导子处理条件下稳定表达的内参基因的应用
【专利摘要】本发明公开了一种GmEF1?α2基因片段作为秦艽根在不同诱导子处理条件下稳定表达的内参基因的应用。本发明采用GmEF1?α2基因片段作为秦艽根在不同诱导子处理条件下的内参基因，通过荧光定量PCR技术检测表明，其在秦艽根受到银离子、铜离子、水杨酸、花生四烯酸、茉莉酸甲酯、柠檬酸铵的处理下可作为分析基因表达时稳定的内参使用，为研究秦艽的功能基因以及次生代谢产物——龙胆苦苷代谢途径的关键酶基因的表达奠定了基础。
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及GmEFl-a2基因片段作为中药秦艽根在 不同诱导子处理条件下稳定表达的内参基因的应用。 GmEFI-α2基因片段作为秦艽根在不同诱导子处理条件下稳定 表达的内参基因的应用
【背景技术】
[0002] 中药秦艽是我国传统名贵中药材，具有祛风湿、清湿热、止痹痛、和血舒筋、利尿等 功效。随着社会发展，市场需求的逐年增大，以及乱采乱挖等原因，致使野生的秦艽资源遭 到极大破坏。自1987年起，秦艽就被我国列为三级重点保护野生药材。秦艽的有效成分主要 是以龙胆苦苷（gentiopicroside)为代表的裂环环稀醚砲苷类（Secoiridiod glycosides)，还包括猜牙菜苦苷（swertiamarin)、猜牙菜苷（sweroside)等。这些次生代谢 产物有着广泛的生物药理性活性，例如健胃、利胆、抗炎、抗真菌、抗组胺等。植物常常会对 诱导子处理产生不同程度的响应，对中药秦艽而言，可体现在次生代谢产物的含量升高或 降低，了解诱导子处理后代谢途径关键酶基因的表达，可为生产实际应用中优化龙胆苦苷 等裂环环烯醚萜苷类的代谢途径，产生更多有效的次生代谢产物提供思路。目前秦艽转录 组数据库的建立，为挖掘该种中药材的基因研究提供了大量的数据资源。
[0003] 研究基因的表达有多种方法，而荧光实时定量PCR(RT-qPCR)因为其快速和可靠地 定量分析基因表达研究而被广泛应用。但是，实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上依 赖于筛选适合的内参基因对目标基因的表达数据进行校正和标准化。所谓内参基因 (Endogenous references gene)即内部参照，主要作为检测目的基因在特定条件下表达水 平变化的参照物，相当于衡量基因表达的一个"标尺"。常用的内参基因应该在生物体各类 细胞中均有表达，它们是在维持细胞基本生命活动中时刻表达的基因，自身表达相对稳定， 不会随着实验材料不同而有较大差异，这样作为一个"标尺"才可靠。然而越来越多的实验 研究发现，一些常用的内参基因并不是在所有的情况下均稳定表达，在特定的实验条件下， 内参基因的表达会发生变化。因此，在选择使用某一个内参基因时，应首先验证其在特定的 条件下是否能够持续稳定的表达。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供GmEFl-a2基因片段作为秦艽根在不同诱导子处理条件下稳 定表达的内参基因的应用，所述GmEFl-a2基因片段的核苷酸序列为 ACGAGGCTCTACAGGAGGCACTTCCTGGTGACAATGTCGGCTTCAACGTGAAAAACGTTGCAGTTAAGGATCTAAAG CGTGGTTATGTAGCATCTAACTCAAAAGACGACCCTGCCAAAGAAGCTGCAAATTTCACATCTCAGGTGATCATCAT GAACCATCCAGGTCAAATCAGCAATGGCTATGCTCCTGTCo
[0005] 采用上述GmEFl-a2基因片段作为秦艽根在不同诱导子处理条件下稳定表达的内 参基因时，使用的特异性引物为：
[0006] GmEFl-a2-F:5' -ACGAGGCTCTACAGGAGG-3';和
[0007] GmEFl-a2-R：5/ -GACAGGAGCATAGCCATTG-37 〇
[0008] 上述GmEFl_a2基因片段由下述方法克隆得到：
[0009] (1)从秦艽中提取总RNA，然后反转录合成CDNA;
[0010] (2)根据转录组数据库中GmEFl-a2基因的核苷酸序列：
[0011] TTCTGATAAGCCCTTGCGTCTTCCACTCCAGGATGTCTACAAGATTGGTGGTATCGGTACTGTCCCAGT GGGTAGAGTCGAGACAGGTGTTCTAAAGCCCGGTATGGTAGTCACCTTTGCCCCAAGTGGACTAACGACTGAAGTGA AGTCCGTAGAGATGCATCACGAGGCTCTACAGGAGGCACTTCCTGGTGACAATGTCGGCTTCAACGTGAAAAACGTT GCAGTTAAGGATCTAAAGCGTGGTTATGTAGCATCTAACTCAAAAGACGACCCTGCCAAAGAAGCTGCAAATTTCAC ATCTCAGGTGATCATCATGAACCATCCAGGTCAAATCAGCAATGGCTATGCTCCTGTCCTGGACTGTCACACGTGCC ATATCGCCGTCAAGTTTGCTGAGCTAGTGACAAAGATCGATAGACGATCTGGGAAAGAACTCGAGAAGGAACCAAAG TTCTTAAAGAACGGTGATGCCGGCATCGTGAAGATGATTCCTACTAAACCAATGGTTGTTGAGACCTTCTCTGAGTA CCCACCCCTTGGAAGATTCGCCGTCAGGGACATGCGGCAGACCGTTGCTGTCGGCGTCATCAAGAGCGTTGAGAAGA AGGATCCATCTGGAGCTAAGTTGACCAAGTCTGCAGTTAAAAAAGTTGGGAAGTGATTGGCACTATCATTTAGTTGT TATTGCATTGTGTACAGGTTATAGTTTTAGTTCCCAGAATATTGGGTCTTAGGCTTAGACCTGTATTGTTTTGTGTC CTTCCTTTTCATTTTTCGCATTTTAGTATTCAGGTTCATCAGCATGTTTCCTTTGGGATCATTTTTAAATAAATAAA CTTTCATTTTATCGTTATAATGTC
[0012] 设计合成特异性引物：
[0013] GmEFl-a2-F:5' -ACGAGGCTCTACAGGAGG-3';和
[0014] GmEFl-a2-R：5/ -GACAGGAGCATAGCCATTG-37 ；
[0015] (3)以CDNA为模板，利用步骤(2)中的特异性引物，PCR扩增GmEFl-a2基因片段，所 述 PCR 扩增的反应条件为:98°(：1〇8、571€38、72°(：1111丨11，30个循环，72°(：延长1〇11^11 ;
[0016] (4)电泳检测步骤(3)所得PCR扩增产物，回收并纯化目的片段，进行测序；
[0017] (5)测序所得的序列分别通过NCBI上BLAST比对和BioEdit本地转录组数据库中分 析比较，进而确定所得核苷酸序列为上述GmEFl-a2基因片段。
[0018] 本发明采用GmEFl-a2基因片段作为秦艽根在不同诱导子处理条件下的内参基因， 以荧光定量PCR技术，通过绝对定量和相对定量分析方法检测目的基因 GmSLS在秦艽根受银 离子、铜离子、水杨酸、花生四烯酸、茉莉酸甲酯、柠檬酸铵处理后，两种分析方法所体现的 表达结果趋势一致，表明GmEFl-a2基因片段可以作为秦艽根在不同诱导子处理条件下的内 参基因，为研究秦艽功能基因的表达奠定了基础。
【附图说明】
[0019] 图1是GmEFl_a2基因片段的溶解曲线。
[0020] 图2是GmSLS基因片段的溶解曲线。
[0021 ]图3是Ct随GmSLS基因片段浓度对数变化的标准曲线。
[0022]图4是以GmEFl-a2基因片段为内参基因分析GmSLS基因片段在秦艽根受到不同诱 导子处理后的相对表达量柱状图。
[0023]图5是GmSLS基因片段在秦艽根受到不同诱导子处理后的绝对表达量柱状图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于 这些实施例。
[0025] 实施例1
[0026]以GmEFl-a2基因片段作为秦艽根在不同诱导子处理条件下的内参基因，GmSLS基 因片段(核苷酸序列为:CACATTCACCATACCATCCAGAAATATGGGAATAAATCAITTACATGGATGGGAAGG ATTCCAAGGGTGAACATTTTAGAGCCAGAACTAGTTAAAGAAATGTTGTTTAACCATGGCAAATTCCAAAAGAATTT TGAGCTCCACAACCCACTTGTTATGCTATTGCTCTCTGGTATTGGAAGT)作为目标检测基因，具体检测方 法如下：
[0027] 1、提取秦艽总RNA
[0028]分别以银离子、铜离子、水杨酸、花生四烯酸、茉莉酸甲酯、柠檬酸铵为诱导子喷施 处理新鲜秦艽，然后将处理后的秦艽根分别放入1.5mL离心管中，用液氮速冻后置于提前去 除RNA酶的研钵中，并在研钵中加入足量的液氮，将样本研成粉末;采用百泰克生物公司多 糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒并按照说明书提取样本的总RNA。
[0029] 2、合成秦艽cDNA
[0030] 所得总RNA经电泳检测、测OD值，选质量好的总RNA为模板，按照TaKaRa Prime ScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒说明书合成cDNA第一链，将合成的cDNA稀释5倍， 于-20 °C冻存，待用。
[0031] 3、合成内参基因的特异性引物
[0032] 上游引物GmEF卜a2-F: 5' -ACGAGGCTCTACAGGAGG-3';和
[0033]
[0034]由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0035] 4、合成目标检测基因的特异性引物
[0036] 上游引物GmSLS-F: 5' -CACATTCACCATACCATCC-3';和
[0037] 下游引物GmSLS-R: 5' -ACTTCCAATACCAGAGAGC-3';
[0038]由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0039] 5、PCR扩增反应
[0040]以诱导子处理下的秦艽根cDNA为模板进行普通PCR扩增。PCR均采用以下25yL反应 体系：超纯水 17yL、10XEX Taq PCR buffer 2.5yL、dNTPs 2yL(2.5mM)、上游引物0.25yL(5 4]\〇、下游引物0.25以以5以]\〇』1了39〇.5以1^、〇0嫩2.5以匕？0財广增反应条件为:98°(：变性1〇8、 57 °C退火30s、72 °C延伸Imin，30个循环，72 °C延伸IOmin。用OMEGA胶回收试剂盒纯化所得 PCR扩增产物，回收目的片段，进行测序，测序所得的序列分别通过在NCBI的BLAST比对和 BioEdit的本地转录组数据库中分析比较，进而确定所得核苷酸序列为上述GmEFl-a2基因 片段和GmSLS基因片段。
[0041] 6、荧光实时定量PCR扩增反应
[0042] 以不同诱导子处理下秦艽根的cDNA为模板，使用RocheLightCyder? 96系统，根据 Takera公司的SYBR?P：remixExTaqTMΠ 试剂盒说明书，反应体系为20μL，其中2X SuperReal PreMix Plus SYBR Premix Ex Taq II(2X)(Tli RNaseH Plus)10yL，上、下游 引物各0.8μLΧ?0μπιο1/υ，cDNA 2yL( 10ng/yL)，用超纯水定容至20yL。荧光实时定量PCR扩 增采用两步法，即在95°C预变性30s后，运行40个循环 ：95°C10s、60°C30S，再运行溶解曲线 (95°Clmin，60°Clmin，60°C-95°C，每30s升高0.5°C收集一次荧光。），得到GmEFl-a2基因片 段和GmSLS基因片段的溶解曲线及阈值循环数(Ct)。由图1~2可见，溶解曲线为单一峰，说 明GmEFl-a2基因片段和GmSLS基因片段的上、下游引物均具有特异性。
[0043] 7、制作标准曲线
[0044] 将步骤5所得GmSLS基因片段进行10倍梯度稀释，稀释成5个浓度梯度，然后分别作 为模板，采用GmSLS基因片段的上、下游引物按照步骤6的方法进行荧光实时定量PCR扩增反 应，得到Ct随GmSLS基因片段浓度的对数为变化的标准曲线(见图3)，标准曲线的拟合方程 为y = -3.8760X+39.8(相关系数R2 = 1.00)，通过标准曲线的斜率(slope)即可得到GmSLS基 因片段的扩增效率E= (10(_1/sl°pe)-1) X 100% = 81 %，说明引物的扩增效率高。
[0045] 8、GmSLS基因的相对表达量
[0046] 根据公式:相对表达量= 2^ΛΛα，其中Δ ACt=(待测组目的基因 Ct值-待测组内参 基因 Ct值)-(对照组目的基因 Ct值-对照组内参基因 Ct值），计算GmSLS基因片段的相对表达 量。结果见图4。
[0047] 9、GmSLS基因的绝对表达量
[0048]根据步骤7得到的Ct随GmSLS基因片段浓度的对数变化的标准曲线，通过荧光实时 定量PCR扩增反应获得秦艽根受到不同诱导子处理后GmSLS基因片段的Ct，以步骤7中标准 曲线的拟合方程y = -3.8760X+39.8，计算GmSLS基因片段在秦艽根受诱导子处理后准确的 基因拷贝数，即GmSLS基因的绝对表达量，结果见图5。
[0049] 对比图4和图5的实验结果可见，在引入GmEFl-a2作为内参基因，GmSLS基因的绝对 定量结果和相对定量结果表现趋势基本一致，说明本发明GmEFl_a2基因片段可以作为秦艽 根在受到不同诱导子处理条件下引入的内参基因。
【主权项】
1. GmEFl-a2基因片段作为秦艽根在不同诱导子处理条件下稳定表达的内参基因的应 用，所述 GmEFl-a2 基因片段的核苷酸序列为 ACGAGGCTCTACAGGAGGCACTTCCTGGTGACAATGTCGG CTTCAACGTGAAAAACGTTGCAGTTAAGGATCTAAAGCGTGGTTATGTAGCATCTAACTCAAAAGACGACCCTGCCA AAGAAGCTGCAAATTTCACATCTCAGGTGATCATCATGAACCATCCAGGTCAMTCAGCMTGGCTATGCTCCTGTC。2. 根据权利要求1所述的GmEFl-a2基因片段作为秦艽根在不同诱导子处理条件下稳定 表达的内参基因的应用，其特征在于:所述GmEFl-a2基因片段作为秦艽根在不同诱导子处 理条件下稳定表达的特异性引物为： GmEFl-a2-F:5'-ACGAGGCTCTACAGGAGG-3';和 GmEFl-c^U' -GACAGGAGCATAGCCATTG-3'。3. 根据权利要求1或2所述的GmEFl-a2基因片段作为秦艽根在不同诱导子处理条件下 稳定表达的内参基因的应用，其特征在于:所述的诱导子包括银离子、铜离子、水杨酸、花生 四烯酸、茉莉酸甲酯、柠檬酸铵的任意一种。
【文档编号】C12Q1/68GK106086219SQ201610702010
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月22日
【发明人】王喆之, 何懿菡, 宋双红, 李焘
【申请人】陕西师范大学