专利名称：eEF-1α作为一种新的水稻内参蛋白质及其抗体的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，具体涉及eEF-lot作为一种水稻免疫印迹研究的内参蛋白质及其相应的抗体的应用。
背景技术：
看家基因是指在生物体内广泛表达的必需基因，这些基因大多负责基础代谢过程，它们往往呈组成型表达，所以在进行表达量的相对比较时被作为内参基因。在生物学实验中，为了对不同样本进行比较，需要选择合适的内参基因进行样品和实验过程的校正和标准化，以便得到可靠的实验结果，所以内参基因的选择和使用具有重要意义。理想的内参基因应在各种实验条件下、在各种类型的组织或细胞中恒定表达。然而，大量的实验结果表明，内参基因的恒定表达都是“有范围”的，在超出范围的实验条件下可能是不适合作为内参的，内参基因使用不当，可能使基因表达的微小差异难以发现，甚至可能引致错误甚至相反的结论，所以对内参基因的进行筛选和评价，确定合适的使用范围是实验设计时应注意的问题。在动物转录水平研究中适合不同物种的内参基因被筛选出来人、鼠、牛、狗、马及海豚。在植物的RT-PCR分析中，适合不同物种的内参基因也被筛选出来拟南芥、小麦、大麦、大豆、番茄、马铃薯、白杨、葡萄、桃、咖啡树及甘蔗。水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，也是植物生长发育、逆境反应等基础研究的模式植物。水稻基因组测序工作的成果极大地推动了水稻相关研究的进展，带动了水稻转录组学研究，利用水稻全基因组基因芯片调查了水稻在杂种优势、逆境、发育过程中的表达谱，对特定目标基因的转录研究也经常使用RT-PCR技术，在RT-PCR 中，筛选并提出了适合水稻的内参基因eEF-la和UBQ5(全称)。水稻基因组学的成果也推动了蛋白质组学的研究，利用2DE-MASS技术对水稻发育、逆境、愈伤组织分化等进行蛋白质组学分析，鉴别了一系列的差异表达蛋白质，同时，随着水稻功能基因组学工作的开展， 对水稻蛋白质功能的验证和比较研究也日益增加，蛋白质印迹(Western blotting, WB)技术因具有灵敏度高、特异性好、操作简便、结果直观等优点而被广泛应用于检测蛋白质在不同组织中的表达水平。显然，在WB技术中需要使用内参来标定上样量从以降低实验误差。 然而有关医学和动物蛋白水平的定量研究中对内参蛋白质的研究表明，实际上常用的内参如Actin，GAPDH，Tubulin在蛋白水平的表达并不稳定，这就不可避免的影响对特定蛋白质功能研究的精确性，因此有必要筛选出适合水稻蛋白水平研究的内参蛋白质。在水稻中并没有系统的内参蛋白质筛选和鉴定工作的相关报道。为此，本发明制备了 9个水稻候选内参蛋白质的抗体，比较了相应蛋白质在水稻不同发育时期/部位的表达，发现eEF-Ι α蛋白质在参试条件下表现稳定性优于Actin、GAPDH和Tubulin等，更适合于作为水稻蛋白质研究的内参，进一步研究发现eEF-Ι α的蛋白水平在白叶枯病抗性反应中和昼夜生长过程中也没有发生变化，证明了 eEF-Ι α的稳定性。在此基础上调查了 eEF_l α蛋白质在水稻总蛋白中的百分含量以及其检测的灵敏度，所制备的抗体可供水稻蛋白质相关定性定量研究采用。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合水稻免疫印迹研究的新的内参蛋白质eEF-Ι α及其相应的多克隆抗体。本发明的第一个目的是提供一种适合水稻免疫印迹研究的内参蛋白质，用不同水稻组织蛋白质进行的免疫印迹实验证明，eEF-la (英文全称为Elongation factor 1-alpha)蛋白质在水稻不同发育时期和不同组织的材料中表达稳定，进一步研究发现 eEF-Ι α蛋白质在水稻接种白叶枯病菌不同时间的材料和水稻昼夜不同时间的材料中同样稳定表达，证明了 eEF-la的稳定性，是一种良好的内参蛋白质。本发明的第二个目的是提供相应的eEF-1 α多克隆抗体，以原核表达的重组抗原 eEF-la为免疫原免疫新西兰大白兔，取其血清测效价达到100000，收集血清，离心后抗原亲和纯化经检测得到特异性好、敏感性强的多克隆抗体。本发明的第三个目的是提供该抗体在水稻及其它植物研究中的用途，包括免疫印迹、蛋白质定量、免疫共沉淀、免疫组化及其它基于抗原抗体反应的应用。为解决以上技术问题，本发明所采用的技术路线为克隆目标基因，在大肠杆菌中体外表达蛋白质，免疫新西兰大白兔，获得免疫血清，纯化后用于免疫印迹实验，结果证明， 利用体外表达的片段蛋白质作免疫原得到的兔源eEF-1 α多克隆抗体能够特异的识别重组抗原和水稻天然蛋白，在实验中的使用效价是1 1000-1 5000;用eEF-1 α抗体检测梯度稀释的重组蛋白，以重组蛋白质量为自变量，以图像信号强度值为因变量，绘制标准曲线，eEF-1 α抗原蛋白质量在1. 5_Mng范围内时与图像信号强度呈线性关系；在标准曲线线性范围内将一系列梯度稀释的重组蛋白和水稻总蛋白一起做免疫印迹，进一步绘制标准曲线，根据标准曲线计算出eEF-la蛋白质在水稻总蛋白中的百分含量大约是0. 10% ；用 eEF-1 α抗体检测梯度稀释的水稻蛋白，发现eEF_l α抗体在水稻蛋白中的最低下限大约是0. 06ng。本发明的优点及其有益效果本发明提供的内参蛋白质eEF-1 α在参试条件下表现稳定，优于Actin、GAPDH和 Tubulin等传统的内参基因，更适合于作为水稻蛋白质研究的内参，而且eEF-1 α的蛋白水平在白叶枯病抗性反应中和昼夜生长过程中也没有发生变化，证明了 eEF-la的普遍适应性。内参蛋白质eEF-1 α来源于水稻(Oryzae Sativa L.)是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的 SEQ ID NO 2 ；2)根据序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸序列预测出的相应抗原片段序列SEQ ID NO 3 ；3)与序列表中SEQ ID NO :2序列中任意连续14个氨基酸的相似性大于80%的多肽片段；上述适合水稻免疫印迹研究的内参蛋白质eEF-Ι α的编码基因SEQ ID Ν0:1，其核苷酸序列符合下述特征1)序列表中SEQ ID No 1的核苷酸序列；
经过验证，本发明中产生的多克隆抗体可应用于蛋白免疫印迹等实验技术中，其特异性和灵敏度高，具有很高的应用价值。此外，在对水稻的研究中，本发明的多克隆抗体可应用于水稻蛋白质水平的科学研究中，也可以用于免疫共沉淀、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白芯片、免疫组化及细胞定位等实验中，此外还可能用于其它植物的相关研究。同时， 用本发明提供的蛋白质制备杂交瘤分泌的单克隆抗体也具有很好的应用前景。
图1是本发明所述的内参基因eEF-Ι α抗原决定簇片段的蛋白质体外纯化结果。图2是本发明所述的eEF-la抗体对重组抗原的免疫印迹检测结果。图3是本发明所述的内参蛋白质eEF-Ι α在水稻不同组织的免疫印迹检测结果。图4是本发明所述的内参蛋白质eEF-Ι α在白叶枯病抗病反应和昼夜生长不同时间点的稳定性检测结果。图5是本发明所述的eEF-Ι α在水稻总蛋白中百分含量的检测结果。图6是本发明所述的确定水稻中eEF-Ι α蛋白含量的标准曲线。
具体实施例方式下述实施例中所用方法均为分子生物学实验室所用的常规方法。生物材料和水稻材料水稻cDNA文库、pET30a_GST表达载体、大肠杆菌ER2566和DH5a菌株等由本实验室保存。限制性内切酶EcoR I、HindIII、T4DNA Ligase、Ex Taq DNA聚合酶购自TAKARA。在水稻材料93-11 (Oryza sativa L. ssp. Indica)苗期(地上部、地下部)、分蘖期(茎、叶)、 孕穗期(剑叶、幼穗)、开花期(剑叶、穗子)、成熟期(剑叶、穗子)共5个时期10个部位分别取材；水稻昼夜生长不同时间点的材料取自93-11，以中午12点为起点，每4小时取样一次；水稻转基因系4021-3是将c-Myc tagged XA21转化TP309而获得的带有纯合XA21 基因的转基因材料，4021-3接种亲合小种PR6后在Oh、lh, 2h，4h，8h，Id, 3d和5d取材，所有水稻材料经液氮速冻后，保存于-70°C备用。实施例1、内参基因eEF-Ι α抗原决定簇预测及引物设计为了制备针对eEF-l α蛋白质的特异抗体，用ΒΕΡΙΤ0ΡΕ软件[28]对eEF_l α基因编码的蛋白质进行抗原决定簇的预测，选出抗原决定簇峰值较高的片段后，用BLASTP对水稻蛋白质库进行唯一性检测后选出目标片段。根据TIGR数据库[14，15]公布的eEF-l α 基因的片段序列设计了扩增引物(下划线是外加的酶切位点)eEF-lα -F :5，~GGAATTCAAGAACGTTGCGGTGAAGG~3’eEF-lα -R 5' ~CCCAAGCTTTCATTTCTTCTTGGCGGCAG~3，实施例2、内参基因eEF-l α的克隆、蛋白质表达纯化以水稻cDNA文库质粒DNA为模板进行PCR扩增，将PCR产物与pET30a表达载体分别用EcoR I和HindIII双酶切，胶回收酶切产物，连接、转化大肠杆菌，重组子送北京华大基因研究中心测序验证后，转化表达菌ER2566，按1 100的比例将过夜菌转接至 100mlLB+Kan50+l %葡萄糖液体培养基中，37°C振荡培养至OD6tltl为0. 6 0. 8，加入0. Imol/ L的IPTG，37°C震荡培养3h，收菌后超声破碎，用Ni柱进行蛋白质的纯化，SDS-PAGE分离后检测发现eEF-Ι α蛋白质的纯度在90%以上，浓度约为1_1. 5mg/mL，可以满足制备抗体的要求(图1)。实施例3、eEF-la多克隆抗体制备及抗体鉴定将纯化的eEF-la融合蛋白质作为免疫原来免疫新西兰大白兔，每隔14天加强免疫一次。；第2次加强免疫后7天耳静脉取血测效价，达要求者颈动脉取血，离心分离血清。 得到的血清进行重组抗原亲和纯化得到多克隆抗体。为了验证抗体的特异性和结合强度， 用抗体对重组抗原进行了免疫印迹检测(图2)，结果表明，所制备的eEF-la多克隆抗体能正确、特异的识别重组抗原，抗体使用浓度在1 1000-1 5000之间。实施例4、水稻不同发育时期eEF-la蛋白质的表达分析选取水稻93-11不同发育阶段和不同部位的组织，提取总蛋白质，用Bradford法测定样品水稻总蛋白含量，每个样品上样5μ g水稻总蛋白，利用制备的eEF-Ι α多克隆抗体检测蛋白质表达(图幻，免疫印迹(Western blotting)可检测到与预期分子量(49kDa) 接近的条带，该蛋白质在水稻的不同组织中都表达且表达量极为相近，因此可以作为水稻蛋白水平研究的内参蛋白质。实施例5、水稻内参蛋白质eEF-la的稳定性验证为了进一步验证eEF-la蛋白质的稳定性，分别检测eEF_l α蛋白质在水稻 4021-3接白叶枯病菌不同时间的材料和水稻93-11 —昼夜不同时间的材料中的表达，结果表明eEF-1 α蛋白质在两种参试材料中均恒定表达(图4)。实施例6、eEF-1 α抗原抗体反应标准曲线的绘制用eEF-1 α抗体检测梯度稀释的重组蛋白，以重组蛋白质量为自变量，以图像信号强度值为因变量，绘制标准曲线。结果表明eEF-la抗原蛋白质量在1. 5 Mng范围内时与图像信号强度呈线性关系。实施例7、内参蛋白质eEF-1 α在水稻总蛋白中百分含量的确定根据绘制的标准曲线，在其线性范围内把梯度稀释的eEF-1 α重组蛋白和水稻总蛋白一起做免疫印迹(Western blotting)(图5)，进一步绘制了更精确的标准曲线(图 6)，根据标准曲线计算内参蛋白质eEF-la在水稻总蛋白中所占的百分含量。结果表明 eEF-1 α蛋白质在水稻总蛋白中的百分含量大约是0. 10%。
权利要求
1.一种水稻eEF-la蛋白质，其特征在于所述蛋白质能够作为水稻的内参蛋白质。
2.权利要求1所述的内参蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有下述氨基酸残基序列之1)序列表中的SEQID NO 2 ；2)序列表中SEQID NO :2的氨基酸序列中任意连续14个(或以上)氨基酸的多肽片段；3)与序列表中SEQID NO :2序列中任意连续14个氨基酸的相似性大于80%的多肽片段；
3.权利要求1所述的蛋白质的编码基因，其特征在于其核苷酸序列为序列表中SEQID No 1的核苷酸序列。
4.一种多克隆抗体，其特征在于所述多克隆抗体是由权利要求2中所述的蛋白质或者多肽之一免疫动物所得。
5.权利要求4所述的多克隆抗体的用途，其在水稻蛋白免疫印迹研究中的应用。
6.权利要求4所述的多克隆抗体的用途，其包括使权利要求4的多克隆抗体与生物样品接触。
7.含有权利要求4所述的免疫印迹试剂，其被用作为检测水稻样品中的蛋白质的用途。
全文摘要
本发明提供了一种适合水稻免疫印迹研究的内参蛋白质eEF-1α，该蛋白质在水稻不同发育时期和不同组织的材料，水稻接白叶枯病菌不同时间的材料和水稻昼夜不同时间的材料中均稳定表达，可以作为水稻免疫研究的内参蛋白质；本发明提供了一种抗水稻eEF-1α的单克隆抗体，该抗体为利用体外表达的水稻eEF-1α片段蛋白质作免疫原免疫新西兰大白兔，得到的抗血清经纯化得到多克隆抗体。该抗体能够特异的识别重组蛋白质和水稻天然蛋白质，在实验中的使用效价是1∶1000-1∶5000；本发明制备的水稻eEF-1α抗体的线性检测范围是1.5-24ng，在水稻蛋白中的最低下限大约是0.06ng；利用标准曲线计算出eEF-1α蛋白质在水稻总蛋白中的百分含量大约是0.10％。
文档编号G01N33/68GK102464707SQ20101053187
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者刘丽娟, 刘国振, 刘斯奇, 吴 琳, 李晓明, 李莉云, 潘秦, 韦汉福 申请人:北京华大蛋白质研发中心有限公司