利用双亲混合dna鉴定水稻品种亲缘关系的方法

利用双亲混合dna鉴定水稻品种亲缘关系的方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物技术领域，具体来说是利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，包括：提取双亲和待测样品DNA，双亲DNA混合样品和待测样品分别进行PCR反应，然后利用双亲DNA混合样品的PCR产物和待检测样品的PCR产物进行电泳检测进行亲缘关系比较。本发明利用双亲混合DNA与对照样品进行PCR产物比较确定水稻品种亲缘关系，不仅减少了样品量，而且准确性强，直观性好。
【专利说明】
利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体来说是利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系 的方法。
【背景技术】
[0002] 随着生物技术的不断发展，基于PCR技术为基础的分子标记已广泛应用于杂交种 子亲缘关系的分析，打击市场上的假冒种子。但目前采用的方法是利用中华人民共和国农 业行业标准的48对引物分别对父本、母本和检测样品进行比较分析(图1所示），确定子一代 与父本、母本是否存在亲缘关系，子一代存在的多态性是否是父本和母本互补的带型，此方 法存在直观性较差的问题。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的是针对上述技术存在的问题，提供一种利用双亲混合DNA鉴定水稻 品种亲缘关系的方法。本发明利用双亲混合DNA与对照样品进行PCR产物比较确定水稻品种 亲缘关系，不仅感少了样品量，而且准确性强，直观性好。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种利用双亲混合DNA鉴定水稻品种 亲缘关系的方法，提取双亲和待测样品DNA，双亲DNA混合样品和待测样品分别进行PCR反 应，然后利用双亲DNA混合样品的PCR产物和待检测样品的PCR产物进行电泳检测进行亲缘 关系比较。
[0005] 进一步的，所述待测样样品DNA提取步骤为:剪取Icm长的幼苗或叶片放入2mL的离 心管中，加入40yL DNA提取试剂I，沸水处理30s，然后加入40yL DNA提取试剂Π 和20yL DNA 提取试剂ΙΠ ，放入沸水处理2min备用。
[0006] 进一步的，所述DNA提取试剂I为250mM的NaOH，所述DNA提取试剂Π 为250mM的HCl， 所述DNA提取试剂ΙΠ 为500mM的Tris (pH8 · 0)、0 · 25 % (V/V)的 IGEPAL-630。
[0007]进一步的，所述双亲DNA提取步骤为:0.5g老叶用液氮研磨成粉末，加入装有0.5mL 2倍CTAB提取缓冲液的2mL离心管中，充分混匀后，加入0.5mL CTAB缓冲液，55-65 °C恒浴 30min，加入0.5-lmL体积比为24:1的氯仿：异戊醇，充分摇动5min，8000转/min室温下离心 5min，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温下静止30min，5000转/min 4°C离心5min，沉淀用 0.8mL高盐缓冲液充分溶解，15000转/min离心2min，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温下 静止3〇111；[11，5000转/111；[114 <€离心5111；[11，沉淀用40(^1^双蒸水溶解，加入2.5倍体积95%的冷 乙醇，-20°C冰箱中2小时以上后15000转离心20分钟，用70 %的冷乙醇洗一次，自然干燥后， 用200μ1 0.1倍TE缓冲液溶解备用。
[0008]进一步的，所述PCR反应体系为 引物 1 μ moL. 聚合酶 0. 2 μ L
[0009] PCR 反应液 IwL 模板 IQ ng dNTP I U mol
[00?0] 反应体系用ddH2〇补足到总体积10yL。
[0011 ]进一步的，所述PCR反应条件为：94°C变性4min，94°C30s、55°C30s、72°C Imin、35个 循环，最后72°C延伸7min。
[0012] 本发明的有益技术效果是:本发明利用双亲混合DNA与对照样品进行PCR产物比较 确定水稻品种亲缘关系，不仅检少了样品量，而且准确性强，直观性好。
【附图说明】
[0013] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0014] 图1是现有技术利用父本、母本和鉴定样品DNA的PCR产物的电泳图谱；图中:M、DNA 分子量标准，1、不育系Y58S(母本），2、恢复系HR-2(父本），3、杂种F1代两优2号（鉴定样品）； 引物依次为 RM274、RM336、RM219、RM1195、RM481、RM224、RM17、RM493。
[0015] 图2是本发明利用父母本混合DNA和鉴定样品DNA的PCR产物的电泳图谱；图中：M、 DNA分子量标准，1、不育系Y58S和恢复系HR-2的混合DNA(父、母本混合DNA)，2:杂种F1代两 优2号DNA(鉴定样品），引物依次为RM274、RM336、RM219、RM1195、RM481、RM224、RM17、RM493。
【具体实施方式】
[0016] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0017] 实施例！
[0018] (1)幼苗的DNA提取
[0019] 剪取Icm长的幼苗或叶片放入2mL的离心管中，加入40yL DNA提取试剂I(250mM NaOH)，沸水处理30s，然后加入40yL DNA提取试剂Π (250ι?Μ HC1)和20yL DNA提取试剂ΙΠ (500mM Tris(pH8 · 0)、0 · 25% (V/V) IGEPAL-630)，放入沸水处理2min备用；
[0020] (2)老叶的DNA提取(CTAB方法）
[0021] 0.5g老叶用液氮研磨成粉末，加入装有0.5mL 2倍CTAB提取缓冲液（2 %CTAB(w/ v),IOOmM Tris(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0), 1.4M NaCl, I%PVP(polyvinylpyrrolidone) Mw40，OOO)的2mL离心管中，充分混匀后，加入0.5mL CTAB缓冲液，55-65 °C恒浴30min，加入 0.5-lmL体积比为24:1的氯仿:异戊醇，充分摇动5min，8000转/min室温下离心5min，上清加 入0.6倍体积的异丙醇，室温下静止30min，5000转/min 4°C离心5min，沉淀用0.8mL高盐缓 冲液（IOmM Tris(pH8.0)，lmM EDTA(pH8.0)，lM NaCl)充分溶解，15000转/min离心2min，上 清加入0.6倍体积的异丙醇，室温下静止30min，5000转/min 4°C离心5min，沉淀用400yL双 蒸水溶解，加入2.5倍体积95%的冷乙醇，-20°C冰箱中2小时以上后15000转离心20分钟，用 70%的冷乙醇洗一次，自然干燥后，用200μl0.1倍TE缓冲液（10mmol/LTris-HCl(pH8.0) lmmol/L EDTA(pH8·0))溶解备用。
[0022] (3)PCR反应及电泳分析
[0023] PCR所用引物如表1所示。
[0024] 衷1引物信息

[0027] ① PCR反应在10μ1的反应体积中进行，包含Ιμπιο?引物，Ιμπιο? dNTP，0.2单位 AmpliTaq Gold DNA聚合酶，ΙμΙΙΟ倍PCR反应液（IOOmmol Tris-Hcl，pH8.3，15mmol MgCl2， 500mmoIKCl，0.01 % 的明胶），模板DNA为IOng。扩增反应条件为:94°C变性4min，94°C 30s、55 °〇3〇8、72°(：11^11、35个循环，最后72°(：延伸71^11。
[0028] ②反应在PE公司9700型基因扩增仪上进行。扩增产物在4%的Nusieve 3:1琼脂糖 凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭染色后在紫外光下观察拍照。所采用的引物为中华人民共 和国农业行业标准，水稻品种鉴定技术规程，SSR标记法，NY/T1433-2014。
[0029] (4)本发明方法(双亲混合DNA和待检测样品）和传统方法(利用父本、母本和待检 测样品)进行亲缘关系结果的比较
[0030] 本研究用不育系Y58S、恢复系HR-2和杂种Fl代两优2号为材料，采用的48对引物为 中华人民共和国农业彳丁业标准，水稻品种鉴定技术规程，SSR标记法，NY/T1433-2014。
[0031] 研究表明，采用不育系Y58S、恢复系HR-2和杂种Fl代两优2号的电泳图谱表明：除 完全表现一致的40对引物外，所有表现出双带的8对引物杂种Fl代具有不育系Y58S和恢复 系HR-2互补的带型，表明杂种Fl代两优2号是不育系Y58S和恢复系HR-2的后代(如图1)。 [0032] 而采用不育系Y58S和恢复系HR-2的混合DNA和杂种Fl代两优2号DNA，除完全表现 一致的40对引物外，通过具有不育系Y58S和恢复系HR-2互补的带型的8引物进行扩增，DNA 指纹图谱完全一致，表明杂种Fl代两优2号是不育系Y58S和恢复系HR-2的后代(如图2)。
[0033] (5)利用双亲混合DNA和检测样品进行亲缘关系的优点
[0034]从图1我们可以看出，要根据图谱来判断3是1和2的后代(杂种Fl代两优2号是不育 系Y58S和恢复系HR-2的后代)必须具有较强的分子生物学基础和经验。而从图2我们可以很 清楚地看出1和2是同一品种，杂种Fl代两优2号是不育系Y58S和恢复系HR-2的后代，直观性 大大加强。此外，样本量由原来的3 X 48减为2 X 48。
[0035] 利用双亲混合DNA和检测样品进行水稻亲缘关系直观性好，准确性强。同时可以用 于其他农作物和动物及人类的亲缘关系鉴定。
[0036]本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术 语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该 理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意 义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
[0037]最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参 照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解:依然可以对本 发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均 应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 利用双亲混合DM鉴定水稻品种亲缘关系的方法，其特征在于，提取双亲和待测样品 DNA，双亲DNA混合样品和待测样品分别进行PCR反应，然后利用双亲DNA混合样品的PCR产物 和待检测样品的PCR产物进行电泳检测进行亲缘关系比较。2. 根据权利要求1所述利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，其特征在于， 所述待测样样品DNA提取步骤为：剪取1cm长的幼苗或叶片放入2mL的离屯、管中，加入40化 DNA提取试剂I，沸水处理30s，然后加入40化DNA提取试剂Π 和20化DNA提取试剂虹，放入 沸水处理2min备用。3. 根据权利要求2所述利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，其特征在于， 所述DNA提取试剂I为250mM的NaOH，所述DNA提取试剂Π 为250mM的肥1，所述DNA提取试剂虹 为500mM的Tris(P册.0)、0.25% (V/V)的IGEPAk630。4. 根据权利要求1所述利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，其特征在于， 所述双亲DNA提取步骤为:0.5g老叶用液氮研磨成粉末，加入装有0.5mL 2倍CTAB提取缓冲 液的2血离屯、管中，充分混匀后，加入0.5mL CTAB缓冲液，55-65°C恒浴30min，加入0.5-lmL 体积比为24:1的氯仿:异戊醇，充分摇动5min，8000转/min室溫下离屯、5min，上清加入0.6倍 体积的异丙醇，室溫下静止30min，5000转/min 4°C离屯、5min，沉淀用0.8血高盐缓冲液充分 溶解，15000转/min离屯、2min，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室溫下静止30min，5000转/min 4°C离屯、5min，沉淀用40化L双蒸水溶解，加入2.5倍体积95%的冷乙醇，-20°C冰箱中2小时 W上后15000转离屯、20分钟，用70%的冷乙醇洗一次，自然干燥后，用20化10.1倍TE缓冲液 溶解备用。5. 根据权利要求1所述利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，其特征在于， 所述PCR反应体系为 引物 1 μ曲OL 聚合酶 0. 2 μ L PCR反应液 1 μ L 模板 10 ng dNTP 1 μ mol 反应体系用d地2〇补足到总体积10化。6. 根据权利要求1所述利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，其特征在于， 所述 PCR 反应条件为:94°C 变性 4111111，941：3〇3、551：3〇3、72°(：1111111、35个循环，最后72°(：延伸 7min〇
【文档编号】C12Q1/68GK106086205SQ201610576328
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月20日 公开号201610576328.7, CN 106086205 A, CN 106086205A, CN 201610576328, CN-A-106086205, CN106086205 A, CN106086205A, CN201610576328, CN201610576328.7
【发明人】詹庆才, 陈静萍, 李祖任
【申请人】湖南省农业生物技术研究中心