一种丝瓜内参基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种丝瓜内参基因，并揭露了利用该丝瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物，不仅解决了现有丝瓜定量PCR检测中没有内参基因的现状；而且所设计的实时荧光定量PCR引物用于丝瓜基因表达分析时，能够提高丝瓜基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测丝瓜时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。
【专利说明】一种丝瓜内参基因及其应用 【【技术领域】】
[0001] 本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及一种丝瓜内参基因及其应用，具体地， 利用该丝瓜内参基因的核苷酸序列为基础设计一对荧光定量特异引物。 【【背景技术】】
[0002] 丝瓜（Luffa cylindrical)原产东印度，主要分布于热带、亚热带的亚洲各地，在 我国南北均有栽培，是我国主要的瓜类蔬菜。随着其分子生物学研宄的不断深入和发展，基 因表达分析正逐渐应用于揭示丝瓜基因调控机理的研宄中。为了避免不同样本在RNA的产 量、质量、逆转录效率以及扩增效率上可能存在的差别，通常利用内参基因进行数据校正和 标准化，以减少样本之间的误差，因此选择合适的内参基因对数据进行校正是得到可信数 据的关键。而18S核糖体脱氧核糖核酸（18S rRNA)存在于所有的真核生物细胞中，几乎在 所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且其作 为内参基因在分析植物基因表达以及检测植物体内的病原物研宄中应用广泛。
[0003] 但目前关于丝瓜18S rRNA基因的克隆和作为关于丝瓜内参基因的研宄还未见报 道。而缺乏内参基因，则难以实现基因表达的校正和标准化，大大阻碍丝瓜各种基因的表达 特性及功能分析研宄。
[0004] 此外，虽然实时荧光定量PCR技术已被广泛应用于多个物种基因表达的绝对定量 和相对定量研宄中，但是因丝瓜内参基因的缺乏，目前尚未发现实时荧光定量PCR技术应 用于丝瓜基因表达的绝对定量和相对定量研宄中的相关报道。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种丝瓜内参基因，并揭露了利用该丝瓜内 参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物。
[0006] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种丝瓜内参基因，所述内参 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；且该内参基因是以丝瓜DNA为模板、并以如下引物 对进行PCR扩增反应所得的；
[0007] 其中引物对为：
[0008] 正向引物 5' -CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT-3'，
[0009] 反向引物 5' -AGGATTCAATCCAGCCACAGGTT-3'。
[0010] 进一步地，以权利要求1中所述内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5. 0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引 物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；
[0011] 且该实时荧光定量PCR引物为：
[0012] 正向引物 5' -GTGTTCTTCGGAATGACTGG-3'，
[0013] 反向引物 5' -ATCGTTTACGGCATGGACTA-3'。
[0014] 本发明的有益效果在于：
[0015] 本发明提供了一种丝瓜内参基因，同时揭露了利用该丝瓜内参基因为基础设计的 实时荧光定量PCR引物，不仅解决了现有丝瓜定量PCR检测中没有内参基因的现状；而且所 设计的实时荧光定量PCR引物用于丝瓜基因表达分析时，能够提高丝瓜基因表达分析研宄 的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大 大的提高了采用实时荧光定量检测丝瓜时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。 【【专利附图】
【附图说明】】
[0016] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0017] 图1是本发明中实施例1的1 %琼脂糖凝胶电泳图。
[0018] 图2是本发明中实施例2的1 %琼脂糖凝胶电泳图。
[0019] 图3是本发明中实施例3的PCR扩增曲线图。
[0020] 图4是本发明中实施例3的溶解曲线图。
[0021] 图5是本发明中实施例4的1%的琼脂糖凝胶电泳图。 【【具体实施方式】】
[0022] 本发明列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于 限制本发明的范围，这些实施例仅用于对本发明进行说明。且各实施例中所采用的仪 器与试剂如下：美国ABI7500实时定量PCR仪，美国ABI Veriti96-well热循环仪，美 国 ABI Power SYBR? Green PCR Master Mix, pMD18-T-vector、cDNA 第一链合成试 剂盒（PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、Marker DL 2000、Taq DNA PolymerashdNTP均为宝生物工程（大连）有限公司产品，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒 为Omega公司产品，引物合成和克隆测序由铂尚生物技术（上海）有限公司完成，其余生化 试剂均为国产分析纯。
[0023] 实施例1内参基因的获得
[0024] 步骤（1)、根据Genbank公布的西瓜、甜瓜及西萌芦的18S rRNA基因设计一对 引物，并利用Clustalx软件对所设计的该引物对进行序列比对，且由铂尚生物技术（上 海）有限公司合成该对引物，具体地，该对引物（如SEQ ID NO :1、2所示）：正向引物 5' -CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT-3'，反向引物 5' -AGGATTCAATCCAGCCACAGGTT-3'。
[0025] 步骤（2)、DNA提取：采用改良CTAB法进行丝瓜基因组DNA的提取，具体地：称取丝 瓜嫩叶0. 5g于研钵中，加入液氮和0. Ig的PVPP快速充分研磨至粉末状，将粉末移至I. 5mL 离心管中；每管加入600 μ L预热至65°C的2% CTAB提取缓冲液，同时加入7ul β -琉基乙 醇，充分混勾，65°C水浴60min，且每隔15min颠倒一次；取出离心管，冷却至室温，接着加入 等体积的氯仿/异戊醇，且氯仿/异戊醇中氯仿、异戊醇二者的体积比为24:1，轻缓颠倒混 匀，静置l〇min，后于4°C下12000rpm离心IOmin ;取上清液至另一离心管，并加入等体积的 氯仿/异戊醇（氯仿/异戊醇中氯仿、异戊醇二者的体积比为24:1)进行再次抽提，同样于 4°C下12000rpm离心IOmin ;取上清液至另一离心管，并加入0. 6倍体积异丙醇，轻缓颠倒 混勾，后于4°C冰箱静置30min-60min，之后在4°C条件下12000rpm离心IOmin ;用体积分数 70 %乙醇洗涤DNA沉淀2-3次，然后置于超净工作台上风干；风干后将所得DNA溶于100 μ L TE溶液中，并加入终浓度为IOmg. mL-1的RNase A 2. 5uL，接着于37°C水浴锅中保温30min， 之后用I %的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA质量；最后将DNA稀释至50ng. L-1，并于-20°c 冰箱中保存备用。
[0026] 步骤⑶、PCR扩增：以经步骤⑶处理所得的DNA为模板，并以步骤⑴中获得的 引物为引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。
[0027] PCR反应体系：反应体系的总体积为25yL，含25ng模板、0.4ymol/L正向引物、 0.4以111〇1/1反向引物、0.15臟〇1/1(1阶1\川了&9〇嫩聚合酶、1.5臟〇1/1]\%(：1 2的10\?0? 缓冲液2. 5 μ L、其余成分为灭菌的超纯水。
[0028] ?0?反应程序为：94°0预变性31^11;94°0变性3〇8,56°0退火3〇8,72°0延伸9〇8,35 个循环；最后72°C下延伸7min ;于4°C下保存。
[0029] 步骤（5)、取步骤⑷所得PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，得到如图1 所示大小的片段，回收该片段并进行纯化后连接到PMD18-T载体上转化，挑取阳性克隆子， PCR检测后送至测序，所测得的序列即为内参基因的核苷酸序列，其如SEQ ID NO :3所示。
[0030] 实施例2实时荧光定量PCR设计和常规PCR检测
[0031] 以实施例1获得的内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5. 0软件， 并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，其扩增片段为 271bp，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物（如SEQ ID NO :4、5所示）： 正向引物 5' -GTGTTCTTCGGAATGACTGG-3'，反向引物 5' -ATCGTTTACGGCATGGACTA-3'。
[0032] 提取丝瓜总 RNA，并按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒 的方法合成cDNA第一链，即将RNA反转录为cDNA ;之后以所得cDNA为模板、以实时荧光定 量PCR引物为引物对进行PCR扩增，且PCR扩增的反应体系与反应程序如下：
[0033] PCR反应体系：反应体系的总体积为25yL，含25ng模板、0.4ymol/L正向引物、 0.4以111〇1/1反向引物、0.15臟〇1/1(1阶1\川了&9〇嫩聚合酶、1.5臟〇1/1]\%(：1 2的10\?0? 缓冲液2. 5 μ L、其余成分为灭菌的超纯水；
[0034] ?0?反应程序为：94°0预变性31^11;94°0变性3〇8,56°0退火3〇8,72°0延伸9〇8,35 个循环；最后72°C下延伸7min ;于4°C下保存。
[0035] 将PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示；由图2可知， PCR扩增得到一条单一条带，没有出现非特异性扩增条带（图2)，经测序大小为271bp，符合 预期大小；则可继续下游的实时荧光定量PCR引物验证。
[0036] 实施例3
[0037] 提取丝瓜总 RNA，并按照 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试 剂盒的方法合成cDNA第一链，即将RNA反转录为cDNA ;之后以所得cDNA为模板、按照 Power SYBR1? Green PCR Master Mix 说明书在 ABI7500 实时定量 PCR 仪上进行 PCR 反 应，PCR反应的反应体系与反应程序如下：
[0038] 反应体系为：反应体系的总体积为25 yL，12. 5 yL Power SYBR? Green PCR Master Mix，IyL模板，实施例2中实时荧光定量PCR引物的正向引物0.5 yL(浓度为 10 μ mol/L)，实施例2中实时荧光定量PCR引物的反向引物0· 5 μ L (浓度为10 μ mol/L)，补 蒸馏水至总体积25 μ L。
[0039] 反应程序为：95°C预变性IOmin ;95°C变性15s，60°C退火lmin，共40个循环；4°C 保存；每个反应做3个重复。
[0040] 反应的结果如图3(其中，ARn指荧光强度、cycle指循环数）所示，从图3可以看 出，3次重复的荧光定量PCR扩增曲线均很好。且为检验反应的特异性， 申请人:在PCR后进 行融解曲线分析，分析结果如图4所示，从图4可显示出，3次重复的Tm(溶解温度）分别为 86. 25°C、86. 06°C、86. 25°C，且均只有一个特异峰，表明无引物二聚体，扩增条带单一，特异 性强，没有非特异性扩增出现，从而表明所设计的一对引物特异性强（即实施例2中的实时 荧光定量PCR引物），扩增效率高，特异性强，能够用于丝瓜荧光定量PCR的内参引物实验。
[0041] 实验例4丝瓜18S rRNA基因表达稳定性分析
[0042] 分别提取丝瓜根、茎、叶、幼瓜（花后5天）、商品瓜（花后12天）、成熟瓜（花后 30天）、高温处理（38°C )叶片、低温处理（8°C )叶片、强光处理（2000umol ·πΓ2 叶片、 及弱光处理（200umol · πΓ2 · S4)叶片的总RNA，之后分别按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的方法合成cDNA第一链，以获得各自的cDNA ;利用实施2中的 实时荧光定量特异引物为引物对，以获得的10种的cDNA为模板，分别进行PCR扩增，PCR扩 增体系与扩增程序如下：
[0043] PCR扩增体系：反应体系的总体积为25 yL，25ng模板、0. 4 ymol/L正向引物、 0.4以111〇1/1反向引物、0.15臟〇1/1(1阶1\川了&9〇嫩聚合酶、1.5臟〇1/1]\%(：1 2的10\?0? 缓冲液2. 5 μ L、其余成分为灭菌的超纯水。
[0044] PCR 扩增程序为：94°C预变性 3min ;94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s，28 个循环；最后72°C下延伸7min ;于4°C下保存。
[0045] 将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示，且图5中标 识1至10分别为丝瓜根、茎、叶、幼瓜（花后5天）、商品瓜（花后12天）、成熟瓜（花后30 天）、高温处理（38°C )叶片、低温处理（8°C )叶片、强光处理（2000umol ·πΓ2 · ?Γ1)叶片、 及弱光处理（200umol · m_2 · s_〇叶片的PCR扩增反应结果；由图5显示，采用实施2中的 实时荧光定量特异引物为引物对时，扩增所得的10个条带亮度基本一致，从而表明在丝瓜 不同组织、各生长发育阶段、及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达，即说明了实时荧光定 量特异引物在丝瓜基因表达中的稳定性，从而适用于丝瓜基因表达的研宄。
[0046] 综上，本发明提供了一种丝瓜内参基因，并揭露了利用该丝瓜内参基因为基础设 计的实时荧光定量PCR引物，不仅解决了现有丝瓜定量PCR检测中没有内参基因的现状；而 且所设计的实时荧光定量PCR引物用于丝瓜基因表达分析时，能够提高丝瓜基因表达分析 研宄的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能 够大大的提高了采用实时荧光定量检测丝瓜时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。
【权利要求】
1. 一种丝瓜内参基因，其特征在于：所述内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示； 且该内参基因是以丝瓜DNA为模板、并以如下引物对进行PCR扩增反应所得的； 其中引物对为： 正向引物 5' -CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT-3'， 反向引物 5' -AGGAITCAATCCAGCCACAGGIT-3'。
2. -种实时荧光定量PCR引物，其特征在于：以权利要求1中所述内参基因的核苷酸 序列为基础，利用Primer Premier5. 0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计 出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物； 且该实时荧光定量PCR引物为： 正向引物 5' -GTGITCTTCGGAATGACTGG-3'， 反向引物 5' -ATCGITTACGGCATGGACTA-3'。
【文档编号】C12Q1/68GK104480202SQ201410725658
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】朱海生, 温庆放, 陈敏氡 申请人:福建省农业科学院作物研究所