一种重组阿魏酸酯酶的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，利用阿魏酸酯酶O42807，密码子优化后人工合成其基因fae、构建pAO815-fae表达载体、构建pPIC9K-fae表达载体以及将pPIC9K-fae表达载体转化至毕赤酵母GS115中表达，得到重组阿魏酸酯酶，SDS-PAGE分析显示其发酵上清液为单一条带，表观分子量为42kDa，酶活为4.7U/mL，比酶活力为31.4U/mg，最适反应温度为50℃，最适pH为5.0～5.5。本发明获得了1株高效表达的重组阿魏酸酯酶转化子，与阿魏酸酯酶O42807相比其表达效率和表达量大大提高。
【专利说明】-种重组阿魏酸酯酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组阿魏酸酯酶的制备方法。
【背景技术】
[0002] 植物细胞壁中，酚酸类物质（如阿魏酸、咖啡酸、对香豆酸等）通过酯键与多糖 (如阿拉伯木聚糖、果糖）的阿拉伯糖基或半乳糖基相连，或者通过醚键与木质素相连，形 成致密的网状结构。阿魏酸酯酶（EC 3. 1. 1.73, Ferul ic acid esterases, FAE)又名肉桂 酸酯酶，它能水解阿魏酸酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，释放出阿魏酸等功 能性物质。阿魏酸酯酶可以辅助木聚糖酶、木质素酶破坏这种致密的网状结构，使细胞壁结 构变得疏松，从而促进木质纤维素完全降解。在工业和农业中阿魏酸酯酶均有重要作用。
[0003] 至今已经从细菌和真菌中分离得到40多种阿魏酸酯酶，但目前报道的阿魏酸酯 酶的酶活及表达量都达不到工业需要。其次，阿魏酸酯酶的分离提取过程相对复杂，难以满 足工业化生产。随着分子生物学的发展，已经有多个阿魏酸酯酶编码基因被克隆，利用现代 生物学技术来改良微生物，使获得高产阿魏酸酯酶菌株成为可能。毕赤酵母表达系统比大 肠杆菌体系有更完备的基因表达调控机制及对表达产物的加工修饰能力，并具有原核细胞 系统生长速度快、便于基因操作和可工业化大规模培养等优点。毕赤酵母可高密度的发酵 培养，其菌体量可达130g/L干细胞重，其在生产单细胞蛋白动物饲料方面发挥重要作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种重组阿魏酸酯酶的制备 方法，构建了分泌型重组质粒pPIC9K-fae，获得了 1株高效表达的重组阿魏酸酯酶转化子， 与阿魏酸酯酶042807相比其表达效率和表达量大大提高。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
[0006] -种重组阿魏酸酯酶的制备方法，包括：
[0007] 1)获得目的基因fae :根据阿魏酸酯酶的氨基酸序列，以毕赤酵母标准密码子优 化设计阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的两端分别引入Hindlll和EcoR I酶切位点， 化学合成如SEQ ID NO. 1所示的基因序列，命名为fae ;
[0008] 2)构建pA0815_fae表达载体：用Hind III和EcoR I双酶切合成的基因序列fae， 连接到经同样双酶切的PA0815上并转化至E. coli DH5 a感受态细胞，得到重组质粒命名 为 pA0815_fae ;
[0009] 3)构建pPIC9K_fae表达载体：以重组质粒pA0815_fae为模板进行PCR扩增，PCR 产物用SnaB I和Not I双酶切，连接到经同样双酶切的pPIC9K上并转化至E. coli DH5 a 感受态细胞，得到重组质粒命名为pPIC9K_fae ;
[0010] 4) fae在毕赤酵母中表达：用Bgl II线性化pPIC9K_fae，电转化毕赤酵母GS115， 涂布于MD平板，筛选MD平板上生长良好的菌落点种至含G418的YH)摇瓶中，筛选抗G418 的重组子，命名为GS115/pPIC9K-fae ;根据毕赤酵母操作表达手册进行GS115/pPIC9K-fae 的诱导表达，得到重组阿魏酸酯酶。
[0011] 一实施例中：所述步骤1)中，根据阿魏酸酯酶042807成熟肽的氨基酸序列， 以毕赤酵母标准密码子优化设计阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的两端分别引入 把11(1111和￡(3〇1?1酶切位点，化学合成如3￡0 10勵.1所示的基因序列，命名为€&6。
[0012] 一实施例中：所述步骤3)中PCR扩增条件为：
[0013] 上游引物：如SEQIDN0. 3所示；
[0014] 下游引物：如SEQ ID NO. 4所示；
[0015] 反应条件：93?95°C变性29?31s，54?56°C退火29?31s，71?73°C延伸 0.9?1. lmin，重复所述变性-退火-延伸共29?31个循环后，71?73°C延伸9. 9? 10.lmin〇
[0016] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
[0017] 一种重组阿魏酸酯酶，所述重组阿魏酸酯酶的基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0018] 本技术方案与【背景技术】相比，它具有如下优点：
[0019] 本发明的一种重组阿魏酸酯酶的制备方法成功构建了分泌型重组质粒 pPIC9K-fae，获得了 1株高效表达的重组阿魏酸酯酶转化子，与阿魏酸酯酶042807相比其 表达效率和表达量大大提高；得到的重组阿魏酸酯酶SDS-PAGE分析显示其为单一条带，表 观分子量为42kDa，酶活为4. 7U/mL，比酶活力为31. 4U/mg，最适反应温度为50°C，最适pH 为 5. 0 ?5. 5。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0021] 图1所示为表达载体pA0815_fae示意图。
[0022] 图2所示为表达载体pPIC9K_fae示意图。
[0023] 图3所示为GS115/pPIC9K_fae转化子PCR电泳图谱。
[0024] 泳道1 :以pPIC9K_fae质粒为模板；泳道2 :以无菌水为对照；泳道3 :DNAMarker ; 泳道4?8 :以GS115/pPIC9K-fae转化子为模板；泳道9 :以质粒pPIC9K转化菌株GS115/9K 为模板。
[0025] 图4所示为SDS-PAGE分析产物的表达。
[0026] 泳道1 :GS115/pPIC9K发酵上清液；泳道2 :蛋白Marker ;泳道3?10 :重组子 GS115/pPIC9K-fae 经诱导培养 0、12、24、48、72、96、120、144h 的发酵上清液。
[0027] 图5所示为GS115/pPIC9k_fae表达量的测定。
[0028] 图6所示为温度对重组阿魏酸酯酶活性的影响。
[0029] 图7所示为pH对重组阿魏酸酯酶活性的影响
【具体实施方式】
[0030] 下面通过实施例具体说明本发明的内容：
[0031] 实施例1 :重组阿魏酸酯酶的制备
[0032] 1)获得目的基因fae :UniProt数据库中筛选高酶活的阿魏酸酯酶042807的氨基 酸序列，该阿魏酸酯酶042807是De Vries RP等从黑曲霉（Aspergillus niger)CBS120. 49 中分离得到的，属于胞外酶；阿魏酸酯酶042807的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，根据 042087的成熟肽序列（如SEQ ID NO. 2所示，22?281为成熟肽序列）以毕赤酵母标准密 码子优化设计阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的两端分别引入HindIII和EcoRI酶 切位点，化学合成如SEQ ID NO. 1所示的基因序列，命名为fae ;
[0033] 2)构建pA0815_fae表达载体：用HindIII和EcoRI分别双酶切合成的基因序列 fae和质粒pA0815,胶回收双酶切片段后用T4DNA连接酶连接并转化至E. coli DH5a感受 态细胞，转化具体条件如下：取200 iiL的E. coli DH5 a感受态细胞与10 yL连接产物（即 上述双酶切片段）混匀，冰浴30min ;于42°C下热激45s，迅速冰浴静置5min ;加入800iiL LB液体培养基，于37°C摇床上低速摇动lh，6000rpm离心2min，去部分上清，留下约200 ii L 上清；重悬细胞沉淀并涂布含100 U g/mL Amp的LB平板，37°C倒置培养14?16h，筛选出 的阳性克隆子（长出的菌落）由Sangon(生工生物工程（上海）股份有限公司）测序，测 序正确的重组质粒命名为pA0815_fae (如图1所示）；
[0034] 3)构建pPIC9K_fae表达载体：以重组质粒pA0815_fae为模板，采用上游引物5' -TACGTAGCCTCTACTCAGGGGATCAGT-3'（如SEQ ID N0. 3所示）及下游引物5'-AATATGCGGCCGC TTACCAAGTACAAGCCCCG-3'（如 SEQ ID NO. 4 所示）进行扩增，PCR 反应条件：94°C变性 30s， 55°C退火30s，72°C延伸lmin，重复所述变性-退火-延伸共30个循环后，72°C延伸10min。 PCR产物经胶回收用SnaB I和Not I双酶切，连接到经同样双酶切的pPIC9K上并转化至 E. coli DH5 a感受态细胞，转化具体条件同2)，筛选出的阳性克隆子由Sangon测序，测序 正确的重组质粒命名为pPIC9K_fae (如图2所示）；
[0035] 4) fae在毕赤酵母中表达：用BglII线性化pPIC9K_fae，所述线性化具体条件为： 利用Bgl II将pPIC9K-fae于37°C水浴4h进行单酶切线性化，酶切体系为：10XTango Buffer 2 ii L、pPIC9K-fae 10 ii L、无菌水7 ii L、Bgl II 1 ii L。线性化后电转化至毕赤酵 母GS115,所述电转化具体条件为：取80 y L毕赤酵母GS115感受态细胞与线性化的DNA轻 轻混匀，转移到冰上预冷的0. 2cm的电转杯中；冰上放置5min，1. 5KV?1. 7KV、200 Q电击 5ms，立即加入lmL预冷的1M的山梨醇，转入2mL EP管中28?30°C静置培养1?2h;力口 入lmL YH)液体培养基30°C、200rpm摇4h ;涂布于MD平板上筛选重组子，取MD平板上生 长良好的菌落用牙签点种至含G418的YH)摇瓶中，筛选抗G418的重组子，命名为GS115/ pPIC9K_fae ;根据Invitrogen公司毕赤酵母操作表达手册进行GS115/pPIC9K_fae的诱导 表达，得到重组阿魏酸酯酶。
[0036] 实施例 2 :GS115/pPIC9K_fae 的鉴定
[0037] 提取实施例1中得到的GS115/pPIC9K_fae的基因组DNA，利用通用引物5' A0X和 3' A0X进行PCR鉴定，结果如图3所示，GS115/pPIC9K-fae构建成功。
[0038] 实施例3 :GS115/pPIC9K_fae表达量的测定
[0039] 重组酵母GS115/pPIC9K_fae的诱导表达参考Invitrogen公司毕赤酵母操作表达 手册，甲醇诱导每隔12h或24h，取发酵上清液进行SDS-PAGE分析，以测定重组阿魏酸酯酶 表达量。如图4所示，在42kDa得到一条清晰条带，而且几乎没有杂条带，初步说明fae得 到成功表达。利用Bradford法测定重组阿魏酸酯酶蛋白含量，HPLC法测定酶活，测定结果 如图5所示,酶活为4. 7U/mL,比酶活力为31. 4U/mg,。
[0040] 实施例4 :重组阿魏酸酯酶粗酶酶学性质的研究
[0041] 1)最适反应温度的测定：取250i! L实施例1中得到的重组阿魏酸酯酶酶液保温 5min后，加入250iiL阿魏酸甲酯溶液（由pH5. 0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液配置），在 40?70°C中反应lOmin，测定重组阿魏酸酯酶的酶活；以所测的最高酶活为100%，计算相 对酶活并绘制相对酶活-pH值曲线；如图6所示，50°C之前重组阿魏酸酯酶的酶活较高，相 对酶活都在80%以上；重组阿魏酸酯酶的最适作用温度为50°C。超过50°C后重组阿魏酸 酯酶的酶活下降较快。
[0042] 2)最适反应pH值的测定：取250 ii L实施例1中得到的重组阿魏酸酯酶酶液50°C 保温5min后，加入250 ii L的阿魏酸甲酯溶液（0. 2mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液调 节pH在4. 0?7. 0之间），50°C下反应lOmin，测定残留酶活；以所测的最高酶活为100%， 计算相对酶活并绘制相对酶活-pH值曲线；如图7所示，pH为5. 0?5. 5,重组阿魏酸酯酶 的酶活最大。
[0043] 以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依 本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
【权利要求】
1. 一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于：包括： 1) 获得目的基因 fae :根据阿魏酸酯酶的氨基酸序列，以毕赤酵母标准密码子优化设 计阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的两端分别引入Hind III和EcoR I酶切位点，化 学合成如SEQ ID NO. 1所示的基因序列，命名为fae ; 2) 构建pA0815_fae表达载体：用Hind III和EcoR I双酶切合成的基因序列fae，连 接到经同样双酶切的PA0815上并转化至E. coli DH5 a感受态细胞，得到重组质粒命名为 pA0815-fae； 3) 构建pPIC9K-fae表达载体：以重组质粒pA0815-fae为模板进行PCR扩增，PCR产 物用SnaB I和Not I双酶切，连接到经同样双酶切的pPIC9K上并转化至E. coliDH5 a 感受态细胞，得到重组质粒命名为pPIC9K_fae ; 4. fae在毕赤酵母中表达：用Bgl II线性化pPIC9K_fae，电转化毕赤酵母GS115,涂布 于MD平板，筛选MD平板上生长良好的菌落点种至含G418的YTO摇瓶中，筛选抗G418的重 组子，命名为GS115/pPIC9K-fae ;根据毕赤酵母操作表达手册进行GS115/pPIC9K-fae的诱 导表达，得到重组阿魏酸酯酶。
2. 根据权利要求1所述的一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于：所述步骤1) 中，根据阿魏酸酯酶042807成熟肽的氨基酸序列，以毕赤酵母标准密码子优化设计阿魏酸 酯酶的基因序列，并在基因序列的两端分别引入Hind III和EcoR I酶切位点，化学合成如 SEQ ID NO. 1所示的基因序列，命名为fae。
3. 根据权利要求1所述的一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于：所述步骤3) 中PCR扩增条件为： 上游引物：如SEQ ID N0. 3所示； 下游引物：如SEQ ID NO. 4所示； 反应条件：93?95°C变性29?31s，54?56°C退火29?31s，71?73°C延伸0? 9? 1. lmin，重复所述变性-退火-延伸共29?31个循环后，71?73°C延伸9. 9?10. lmin。
4. 一种重组阿魏酸酯酶，其特征在于：所述重组阿魏酸酯酶的基因序列如SEQ ID NO. 1 所示。
【文档编号】C12N9/18GK104450644SQ201410724759
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】李夏兰, 张光亚, 陈云华, 陈培钦, 葛慧华 申请人:华侨大学