用于从阿魏酸快速和高产率产生香草醛的恶臭假单胞菌kt2440的基因工程化的制作方法
【专利说明】用于从阿魏酸快速和高产率产生香草醛的恶臭假单胞菌 KT2440的基因工程化
[0001] 本发明涉及基于基因工程假单胞菌菌株从阿魏酸产生香草醛酸的改进的生物催 化方法，以及涉及所述假单胞菌菌株。 技术背景
[0002] 香草醛（4-羟基-3-甲氧基苯甲醛），香草兰香料的感官化合物，是全世界数量上 最广泛使用的调味剂之一。其需求量长久以来超过植物源香草兰（Vanilla planifolia) 的供应量。目前，大部分香草醛从愈创木酚（源自化石原料）和木质素（来自木浆业的废 料中的组分）化学地合成（Ramachandra Rao和Ravishankar，2000)。然而，对这种"等同 天然的"香草醛（大多用于食物和饮料工业中）的需求转向"天然"香草醛，原因在于消费 者的健康和营养意识不断上升。因此，生物技术生产"天然"香草醛变得越来越重要（综述 见 Krings 和 Berger，1998 ;Priefert 等人，2001)。
[0003] 已经尝试通过体外培养的香草兰细胞产生香草醛（Davidonis和Knorr，1991)。 还使用基因修饰的酵母株实施从头合成（Hansen等人，2009)。然而，主要重点放在使用分 离的酶或不同原核微生物作为完整细胞生物催化剂的生物转化方面（Havkin-Frenkel和 Belanger, 2008 ；Berger,2009)〇
[0004] 除了木质素和酚类芪如丁香酚外，阿魏酸生物转化成香草醛是研究最充分的产生 "天然"香草醛的方法（综述见Rosazza等人，1995 !Priefert等人，2001)。前体阿魏酸 (3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基）丙-2-烯酸）（一种羟基肉桂酸），是高度丰富的物质，原 因在于它是许多植物细胞壁的组分（Ishikawa等人，1963 ;Escott_Watson和Marais，1992 ; Ishii，1997;0osterveld等人，2000)。已经评价了用于从阿魏酸产生香草醛的许多不同微 生物，包括大肠杆菌（E.coli)、假单胞菌属（Pseudomonas ssp.)、红球菌属（Rhodococcus ssp·)、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)、黑曲霉（Aspergillus niger)、朱红秘孔 菌（Pycnoporous cinnabarinus)、拟无枝酸菌属（Amycolatopsis ssp.)和链霉菌属 (Streptomyces ssp.)的重组菌株（Lesage-Meessen 等人，1996 ;0keke 和 Venturi，1999 ; Muheim 和 Lerch，1999 ;Achterholt 等人，2000 ;0verhage 等人，2003 ;Peng 等人，2003 ; Plaggenborg 等人，2006 ;Yoon 等人，2007 ;Barghini 等人，2007 ;Hua 等人，2007 ;Di Gioia 等人，2010 ;Tilay等人，2010 ;Fleige等人，2013)。然而，在大多数情况下，香草醛产率低 并且生物转化反应缓慢。低产率可以大多归因于香草醛的高度毒性（Krings和Berger， 1998)。用吸附剂树脂增强香草醛的产生改进了香草醛水平直至19. 2g I1，但是约43%的 摩尔产率相当低（Hua等人，2007)。其他缺点是异源基因表达低效和质粒不稳定。重点还关 注防止香草醛进一步降解成香草醇或香草酸（Stentelaire等人，1997 !Bonnin等人，1999 ; Oddou 等人，1999 ;Civolani 等人，2000 ;0verhage 等人，2000)。
[0005] 来自假单胞菌属（Pseudomonas)的细菌显示宽大的代谢通用性，因为它们可以利 用广泛类型的芳族分子作为唯一碳源（Clarke，1982)。假单胞菌属物种菌株HR199、荧光假 单胞菌（P.fluorescens)BF13和恶臭假单胞菌（P.putida)KT2440中的阿魏酸分解代谢通 过如图1中所示的辅酶A-依赖性非β氧化途径发生（Narbad和Gasson，1998 ;Gasson等 人，1998 ;Overhage 等人，1999b ;Plaggenborg 等人，2003 ;Calisti 等人，2008)。首先，通过 阿魏酰辅酶A合成酶（EC 6. 2. 1. 34 ;由fcs编码）催化，阿魏酸活化成阿魏酰辅酶A。接着， 通过烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶（EC 4. 2. 1. 101 ;由ech编码）催化，将CoA硫酯水合并裂 解成香草醛和乙酰-CoA。香草醛脱氢酶（EC 1. 2. 1. 67 ;由vdh编码）使香草醛氧化成香草 酸，后者通过香草兰酸-0-脱甲基酶（EC1. 14. 13. 82 ;由vanAB编码）进一步分解代谢成原 儿茶酸。Overhage等人（1999b)还提出一条由PP_3355(aat)编码和可能由PP_3354编码 的酶所催化的经4-羟基-3-甲氧苯基-β -酮丙酰-CoA和香草基-CoA的第二途径。
[0006] 最近研究已经使用荧光假单胞菌的代谢工程化菌株用于从阿魏酸产生香草醛（Di Gioia等人，2010)。通过缺失香草醛脱氢酶基因 vdh和通过在低拷贝载体上过量表达结构 基因 fcs和ech，作者能够从IOmM阿魏酸产生至多8. 41mM香草醛，这是迄今用假单胞菌菌 株产生的香草醛最高的最终滴度。
[0007] 用于微生物产生香草醛的现有技术方案仍然具有以下一个或多个缺点：低阿魏酸 转化率、低香草醛摩尔产率、明显副产物形成。
[0008] 奠定本发明基础的问题因此是提供避免至少一个上文所述缺点的方法。
[0009] 发明简述
[0010] 通过以下方式解决了上文提到的问题：提供假单胞菌属细菌的基因工程菌株，所 述基因工程菌株具有借助辅酶A依赖性非β氧化途径催化阿魏酸分解代谢成香草醛的能 力。
[0011] 在一个具体实施方案中，使用非致病性完全测序的恶臭假单胞菌菌株 ΚΤ2440 (ATCC47054) (Nelson等人，2002)，所述菌株是生物安全菌株恶臭假单胞菌mt-2的 无质粒衍生物（Kojima 等人，1967 !Williams 和 Murray，1974 ;Nakazawa，2002)。通过基因 修饰，可以建立一种使用无质粒静息恶臭假单胞菌突变体细胞，将阿魏酸生物转化成香草 醛的高度高效方式。特别地，使用upp反选择系统（Graf和Altenbuchner，2011)对恶臭假 单胞菌KT2440的遗传操作产生能够将阿魏酸快速转化成香草醛，同时摩尔产率高达86%、 生产率高和仅少量副产物形成的细胞。
[0012] 遗传优化所述非致病恶臭假单胞菌菌株KT2440以将阿魏酸以特别方式转化成香 草醛。缺失香草醛脱氢酶基因（vdh)不足以防止香草醛降解。通过转座子诱变鉴定的钼酸 盐转运蛋白额外失活产生不能够依赖香草醛作为唯一碳源生长的菌株。通过引入强tac启 动子系统增强阿魏酰辅酶A合成酶（fcs)和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶（ech)的结构基因 的染色体表达，进一步优化生物转化。进一步基因工程仅在3小时内就导致高达86%的高 初始转化率和高摩尔香草醛产率，伴随很低的副产物水平。这代表了迄今用假单胞菌菌株 获得的最高生产率和摩尔香草醛产率。连同其高阿魏酸耐受性，新开发的无质粒假单胞菌 菌株代表了生物技术产生香草醛的有前景候选者。
[0013] 附图简述
[0014] 图1 :提出在假单胞菌菌株中阿魏酸经香草醛分解代谢的途径。右侧显示从4-羟 基-3-甲氧苯基-β -轻丙酰-CoA至香草酸的备选途径（由Overhage等人，1999b提出）。 由虚线箭头指示香草醛还原成香草醇。问号代表未知酶催化的反应。
[0015] 图2 :本发明中所用的恶臭假单胞菌突变株中烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶（ech)、 阿魏酰辅酶A合成酶（fcs)和香草醛脱氢酶（vdh)、β -酮硫解酶（aat)和酰基-CoA脱氢 酶（PP_3354)的结构基因的组织架构。描绘了包含Iac操纵基因（PtaJ和Iac阻遏蛋白基 因（IacI q)的tac启动子区的整合位点。
[0016] 图3 :恶臭假单胞菌突变菌株GN23、GN235、GN275和GN276在具有不同碳源的M9 极限培养基中的生长。如通过箭头所示，菌株以0.050?。。接种。通过测量0D_记录生长。 提供在30°C时24小时后的OD 6。。以显示菌株分别以葡萄糖、阿魏酸、香草酸和香草醛作为唯 一碳源生长的能力。
[0017] 图4:阿魏酸至香草醛的生物转化测定法。用恶臭假单胞菌菌株（a)GN23、（b) GN235、（c)GN276、（d)GN299、（e)GN347、（f)GN440、（g)GN441 和（h)GN442 的 5x IO9个静息 细胞ml 1启动阿魏酸生物转化成香草醛之前，将代谢基因 ech和fcs用5mM IPTG诱导6小 时。通过HPLC测量阿魏酸（黑色圆圈）、香草醛（白色圆圈）、香草醇（黑色三角形）和香 草酸（白色三角形）的浓度并且对转化时间作图。本图显示至少三个独立重复的测定法的 均值。标准差小于10%。
[0018] 图5 :诱导物IPTG的量对阿魏酸生物转化成香草醛的影响。用5x IO9个静息细 胞ml 1启动阿魏酸生物转化成香草醛之前，将细胞恶臭假单胞菌GN299用（a) ImM IPGT和 (b)5mM IPTG诱导6小时。通过HPLC测量阿魏酸（黑色圆圈）、香草醛（白色圆圈）、香草 醇（黑色三角形）和香草酸（白色三角形）的浓度并且对转化时间作图。本图显示至少三 个独立重复的测定法的均值。标准差小于10%。
[0019] 图6 : (a)诱导时间和（b)恶臭假单胞菌GN299静息细胞的数量对阿魏酸生物转化 成香草醛的影响。（a)用5x IO9个静息细胞ml 1启动阿魏酸生物转化成香草醛之前，将细 胞用5mM IPTG诱导2小时、4小时和6小时。（b)用变动数量的静息细胞（5x、IOx和20x IO9个细胞ml 3启动阿魏酸生物转化成香草醛之前，将细胞用5mM IPTG诱导6小时。通 过HPLC测量并且在生物转化测定法开始（0小时）和结束（18小时）显示阿魏酸（黑色条 形）、香草醛（白色条形）、香草醇（深灰色条形）和香草酸（浅灰色条形）的浓度。本图 显示至少三个独立重复的测定法的均值。标准差由误差线表示。
[0020] 图7 :(a)阿魏酸浓度和（b)香草醛浓度对生物转化的影响。用恶臭假单胞菌 GN299的5x IO9个静息细胞ml 1启动阿魏酸生物转化成香草醛之前，将代谢基因 ech和fcs 用5mM IPTG诱导6小时。（a)渐增浓度的阿魏酸（10、20、30和40mM)用于向香草醛转化。 (b)渐增浓度的香草醛（0、10、15、20和30mM)在生物转化测定法开始随IOmM阿魏酸一起 添加。通过HPLC测量并且在生物转化测定法开始（0小时）和结束（18小时）时显示阿魏 酸（黑色条形）、香草醛（白色条形）、香草醇（深灰色条形）和香草酸（浅灰色条形）的 浓度。本图显示至少三个独立测定法的均值。标准差由误差线表示。
[0021] 图8 :M9极限培养基中恶臭假单胞菌突变株GN299对不同（a)阿魏酸浓度和（b)香 草醛浓度的耐受性。在含有0.4%葡萄糖和渐增浓度的（a)阿魏酸和（b)香草醛的M9极限 培养基素中以〇. l〇D_接种后，通过测量OD _记录生长。提供在30°C时24小时后的OD 6。。 以分别显示GN299对阿魏酸和香草醛的不同浓度的耐受性。本图显示至少三个独立测定法 的均值。标准差由误差线表示。
[0022] 发明详述
[0023] A. -般定义
[0024] "去调节"应当以其最广意义理解（上调或下调、放大或衰减、增加或降低活性/功 能），并且包括通过本领域技术人员熟知的不同手段增加或下降或完全关闭或开启靶，例如 酶（靶酶）活性或其他有代谢活性的蛋白质（靶蛋白）活性。
[0025] 合适操作可以在蛋白质/酶水平进行，改变氨基酸序列或氨基酸残基；或可以在 核酸水平进行，改变例如遗传信息或调节遗传元件。合适的方法包括例如增加或减少基因 工程生物中基因和/或酶/蛋白质分子的拷贝数，或调整酶的另一个特征，影响其酶活性， 或调整蛋白质的另一个特征，影响其生物活性（例如代谢活性），这随后对讨论的代谢途径 产生所需的影响。
[0026] 合适的遗传操作还可以包括，但是不限于，改变或修饰与特定基因表达相关的调 节序列或位点（例如通过移除或引入强启动子、诱导型启动子或多个启动子）、调整特定基 因的染色体位置、改变与特定基因毗邻的核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子、减少 或增加特定基因的拷贝数、修饰参与特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质（例 如，调节蛋白、阻抑蛋白、增强子、转录激活物等），或本领域常规的去调节特定基因表达的 任何其他常规手段（包括但不限于使用反义核酸分子或其他方法以敲除或阻断靶蛋白的 表达）。
[0027] 更具体地，术语"去调节"、"去调节的"和"去调节作用"指改变或修饰微生物中的 至少一个基因，其中相对于该改变或修饰不存在时的香草醛产量，所述改变或修饰导致微 生物中香草醛产生效率增加。在一些实施方案中，被改变或修饰的基因编码生物合成途径 中的酶或转运蛋白，从而改变或修饰微生物中生物合成酶的水平或活性或改变或修饰运输 特异性或效率。在一些实施方案中，改变或修饰了编码生物合成途径中酶的至少一个基因， 从而该酶的水平或活性相对于未改变基因或野生型基因存下的水平增强或增加。去调节作 用还包括改变一个或多个基因的编码区以产生例如具有反馈抵抗性或具有更高或更低比 活性的酶。另外，去调节进一步涵盖编码转录因子（例如，激活物、阻遏蛋白）的基因的遗传 变异，所述转录因子调节编码酶或转运蛋白的基因的表达。更具体地，去调节可以导致"降 低的"酶活性，其中所产生的酶活性小于如非去调节状态下所观察到的酶活性的100%，或 被"关闭"，即可逆或不可逆关闭、不再存在或通过常规分析工具（如酶活性测定法）至少不 再可检出。
[0028] 上调的特定方式是放大靶基因，尤其通过实施增加基因活性的"向上"突变（例如 通过使用强表达信号的基因放大）和/或增强或增加蛋白质的酶活性或代谢活性的点突变 来放大。
[0029] 下调的优选方式是衰减靶基因，尤其通过实施降低基因活性的"向下"突变（例如 通过基因缺失或破坏、使用弱表达信号）和/或摧毁或降低蛋白质的酶活性或代谢活性的 点突变来降低。
[0030] 特别地，可以如此操作基因，从而将一个或多个核苷酸从宿主生物的染色体缺失。 也可以通过引入导致基因产物活性降低的一个或多个基因突变，获得降低的基因产物活 性。降低的活性可以是酶活性或其他代谢活性降低> 50%未突变或未改变的酶活性，或活 性降低> 90 %，或活性更优选地降低> 95 %，或活性更优选地降低> 98 %，或活性甚至更 优选地降低> 99%或活性甚至更优选地降低> 99. 9%。
[0031] 也可以通过引入导致基因产物活性增加的一个或多个基因突变，获得增加的基因 产物活性。增加的活性可以是酶活性或其他代谢活性增加例如1倍至1000倍未突变或未 改变的酶活性，或活性增加2倍至100倍，或更优选地，活性增加5倍至50倍或10倍至20 倍。
[0032] 术语"异源"或"外源"指如本文所述的蛋白质、核酸和相应序列，它们被引入如本 文定义的遗传操作（工程化）的微生物中或由其产生（转录或翻译）并且所述微生物在所 述操作之前不含有或不产生所述序列。特别地，所述微生物在所述操作之前可以不含有或 不表达所述异源酶活性，或可以含有或表达具有可比活性或特异性的内源酶，所述内源酶 由不同编码序列编码或由具有不同氨基酸序列的酶编码，并且所述内源酶可以转化与所述 外源酶相同的底物或多种底物。
[0033] "微生物"指真核生物并且尤其指原核生物，并且更具体地指细菌。
[0034] "衍生自亲本微生物"的微生物指通过任何类型的操作或这类操作的组合修饰的 微生物，所述操作选自化学技术、生物化学技术或微生物技术，尤其基因工程技术。在后一 种情况下，它们称作"基因工程"微生物或"基因修饰"微生物。所述操作导致所述亲本微 生物的生物学特征的至少一种变化。作为一个例子，可以将异源酶的编码序列引入所述生 物或可以缺失亲本微生物的编码序列。借助所述变化，可以向所述亲本微生物增加至少一 个特征、替代其中的至少一个特征或从中缺失至少一个特征。所述变化可以例如导致所述 微生物的代谢特征如此改变，例如，所述微生物表达的酶的底物（所述亲本微生物过去根 本无法利用或以不同效率利用所述底物）以特征性方式（例如，如果与亲本微生物相比，按 不同的量、比例或以不同效率）代谢，和/或代谢终产物或中间产物由所述修饰的微生物以 特征性方式（例如，如果与亲本微生物相比，按不同的量、比例或以不同效率）形成。
[0035] 可以将微生物按物理或环境方式改变或"修饰"，以相对于起始微生物的基因产物 的表达水平，按升高或更低的水平表达基因产物。例如，微生物可以用下述（化学或遗传） 试剂处理或在下述（化学或遗传）试剂存在下培养，其中所述试剂已知或疑似增加或减少 特定基因的转录和/或翻译和/或特定基因产物的翻译，从而增加或减少转录和/或翻译。 备选地，可以在下述温度培养微生物，其中选择所述温度以增加或减少特定基因的转录和/ 或翻译和/或特定基因产物的翻译，从而增加或减少转录和/或翻译。
[0036] "基因修饰的"指按照上文意义通过本领域可获得的基因工程技术（例如转化、突 变、同源重组）改变的微生物。
[0037] 术语"能够利用"指本发明微生物将底物（例如阿魏酸）转化成至少一个在结构 上和/或空间上不同的化学产物的能力。
[0038] "参与阿魏酸发酵转化成香草醛或与之相关的酶活性"意指影响阿魏酸转化成香 草醛和/或副产物的酶的任何催化活性或调节活性，如可以通过如下文定义的任何参数集 合确定。
[0039] 不同产量参数（"产量"或YP/S ;"比生产率产量"；或空间-时间-产量：（STY)) 是本领域熟知的并且例如由Song和Lee，2006所述那样测定。
[0040] "产量"和"YP/S"（各自以所产生产物的质量/所消耗物料的质量表述）在本文 中作为同义词使用。
[0041] 比生产率-产量描述每小时和每升发酵液每g生物质产生的产物（如香草醛）的 量。称作WCW的细胞湿重的量描述了生物化学反应中有生物活性的微生物的量。该值作为 g产物/gWCW/小时（即g/gWCW 1Ii 3给出。
[0042]