具有增强特性的火山鬃菌属磷酸三酯酶样内酯酶(pll)及其用图
【专利说明】具有增强特性的火山鬃菌属磷酸三酯酶样内酯酶（PLL)及 其用途
[0001] 本发明涉及具有增强特性的火山鬃菌属磷酸三酯酶样内酯酶（Vulcanisaetal Phosphotriesterase-Like Lactonase) (PLL)及其用途，尤其是作为有机磷化合物的生物 清除剂或者作为使用内酯进行通讯的细菌的群体猝灭剂（quorum quencher)。
[0002] 有机磷酸酯（OP)杀虫剂已经成为目前可以利用的最广泛使用的杀虫剂。在农业 上、家庭中、公园和兽医实践中，使用0P。由于大部分的这些化合物抑制了一些酯酶，所以暴 露于OP可以通过多个途径导致严重的毒性。OP不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶（哺乳动物神 经系统的一种重要的酶），导致所有脊椎动物严重的损害。酶功能的损失导致乙酰胆碱在肌 体的不同区间中累积，从而导致肌肉收缩、瘫痪和呼吸抑制。肺分泌增加伴有呼吸衰竭是有 机磷酸酯中毒而导致死亡的通常原因。
[0003] 在第二次世界大战之前，军队也研发出一些0P。对毒性改善和/或稳定性提高的 OP的发现导致化学战剂（CWA)的研发，例如沙林、梭曼、塔崩或VX。此外，OP杀虫剂（与CWA OP相比，容易获得，但是毒性不那么低）构成了人群的重要危险。面对这些增加的威胁，解 毒剂的研发便更迫切了。
[0004] 由于OP的疏水性，其通过吸入、消化和皮肤渗透而高效地吸收。中毒的发生取决 于化合物的吸收速率。根据接触的方法，急性OP中毒的症状在暴露过程中或暴露过程后， 在几分钟至几小时内发展。通过吸收而暴露导致毒性症状最快地出现，然后是胃肠道途径， 最后是皮肤途径。
[0005] 保护性外套和面具并不总是提供针对OP的有效保护。在通过OP污染皮肤、衣物 或毛发而中毒的患者中，必须使用手术皂或洗衣去污剂来进行去污过程。治疗高度污染的 人得施用阿托品或安定，其在具有毒蕈碱受体的终末器官中，拮抗过量浓度的乙酰胆碱的 作用。不幸的是，阿托品对烟酸作用是无效的，烟酸样作用在严重中毒的情况下具体为肌无 力和呼吸抑制。当在中毒后快速给药磷定（一种胆碱酯酶活化剂）时，其减轻OP中毒的烟 酸以及毒蕈碱作用。使用此类化合物对沙林（一旦被吸入，其保持了极快速的作用）是无 效的。此外，清洁气道及改善组织氧化也是极有帮助的。
[0006] 尽管上述技术形成了预防中的一些进展，但是现有的对这些中毒的保护以及治疗 仍然是不令人满意的。
[0007] 在90年代早期，在几种细菌中识别了最初的OP水解酶（Cheng et al. , 1993, Appl. Environ. Microbiol. ,59:3138-3140, Raveh et al.,1993,Biochem Pharmacol.，45:2465-2474)。丁酰胆碱酯酶（BChE)-和乙酰胆碱酯酶（AChE)-基OP生物 清除剂被认为是潜在的化学计量陷阱。不幸的是，由于它们与OP的低化学计量结合能力， 所以需要巨大量的BChE或AchE来治愈中毒的个体。这导致不成比例地且非常昂贵地使用 这些酶。
[0008] 统称为磷酸三酯酶（PTE)的一些其他微生物酶显示对于具有P-O或P-S键的有机 磷化合物的偏好。这些酶是氨基水解酶超级家族的成员，是催化水解具有不同化学特性的 广泛化合物（磷酯、酯、氨基化合物等）的酶。在土壤细菌中分离出它们的编码基因 opd(有 机磷酸盐降解基因），其中所述的细菌例如有缺陷假单胞菌（Pseudomonas diminuta)， 也称为缺陷短波单胞菌（Brevundominas diminuta) (Munnecke et al.，1976, Appl. Environ. Microbiol. ,32:7-13);产黄菌属（Flavobacterium)的菌种（Sethunathan et al.，1973, Can J Microbiol, 19:873-875);和放射形土 壤杆菌（Agrobacterium radiobacter) (Horne et al.，2003，FEMS Microbiol Lett, 222:1-8)，此外，在古生菌中还 识别出类似于 opd 的基因 （Merone et al·，2005, Extremophiles, 9:297-305) 〇
[0009] 内酯是细菌合成的信号传导分子，从而允许它们用于检测群体的密度。这些细胞 至细胞的通讯的过程称为群体感应（QS)，并且公知地，用于调控细菌的许多关键生物学功 能，包括生物膜形成（Popat et al.，2008，British Medical Bulletin, 87:63-75)。QS 与 毒力之间的连接成为许多细菌感染的发病机理的中心，包括铜绿假单胞菌（P. aeruginosa) (Sakuragi et al.，2007, J Bacteriol, 189:5383-5386)，而且还包括鲍曼不动杆菌 (A.baumanii) (Stacy et al·，2012, ACS Chem Biol, 7 (10) :1719-1728),伯克霍尔德氏菌 属物种（Bulkolderia sp.) (McKeon et al.，2011，J Infect Dis，Feb 1;203(3):383_92)， 弧菌属（Vibrio)的菌种（Augustine et al·，2010, Arch Microbiol 192(12):1019-1022) 或者胡萝卜欧氏杆菌（E.caratovora) (Dong et al·，2001，Nature, 411:813-817)。干 扰QS系统（也称为群体猝灭）是在植物和动物中控制细菌疾病的有前途的方法（Dong et al.，2001，nature, 411:813-817)。N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)为介导许多革兰氏 阴性细菌和一些古细菌有机体的细菌通讯的分子（Zhang et al.，2012, ISME J.，Jul; 6(7):1336-44)。其传统上调节感染和毒力功能。这些分子在介质中累积，从而达到可 以改变细菌转录图谱的某一阈值（Hentzer et al.，2003，Embo J, 22:3803-3815)。通 过水解AHL，内酯酶样PLL可以猝灭细菌之间AHL介导的通讯，如同人类对氧磷酶（Ma et al·，2009,Appl Microbiol Biotechnol, 83:135-141)或 AiiA 内酯酶（Dong et al·，2001，Nature, 411:813-817)中可见。由于PLL的双重催化活性（内酯酶和磷酸三酯 酶），PLL构成了作为群体淬灭试剂或OP生物清除剂，用于生物技术用途的有高度吸引力的 候选物。
[0010] 最近，在日本和俄罗斯，已经发现了属于泉古菌门（Crenarchaeota)的新的嗜 热细菌。在火山地区的温泉中发现了火山鬃菌属的菌种。为了了解这种古细菌的生理 特性及它们的可能的生态作用，对目前已知的2种火山鬃菌属菌种（V. distribute和 V.moutnovskia)的完整基因组进行测序（Mavromatis et al·，2010, Stand Genomic Sci.; 3(2):117-25/Gumerov et al.，2011，J Bacteriol. ;193(9):2355-6)。在编码蛋白质的基 因中，几条序列与编码极端嗜热PTE或硫叶菌PLL内酯酶的序列具有相似性，从而假定一些 相似的酶活性。
[0011] PTE基因与V. moutnovskia基因的系统发生学和序列比对显示一致性百分率接近 30%。由于已知的OP水解酶与内酯酶的序列一致性低（最大50% )，所以可以高度地预计 不同的底物特异性和催化特性。
[0012] 本发明的一个方面提供了具有内酯酶活性的新型突变的极端嗜热PTE，其具有以 下2种优点：
[0013] -比野生型极端嗜热PTE，针对OP更高的活性，或者针对AHL更高的活性，或者针 对OP和针对AHL更高的活性；
[0014] -比嗜温PTE更稳定并且更廉价地生产。
[0015] 本发明的另一个方面考虑了用于建立突变的极端嗜热PTE变体文库的方法。
[0016] 本发明的另一个方面提供了用于对材料、皮肤、毛发或粘膜的被OP污染的表面进 行去污的有效工具。所述的工具可以为具有新的突变的极端嗜热PTE的组合物、生物清除 剂、去污盒、去污试剂盒、浸渍材料。
[0017] 本发明的另一个方面提供了能够以降低的成本大规模合成新的突变的极端嗜热 PTE的载体和宿主细胞。
[0018] 本发明的另一个方面涉及在对被有机磷化合物污染的材料表面、皮肤或粘膜进行 去污的背景下，或者在被有机磷化合物污染的水进行污染控制的背景下，或者在破坏大量 神经毒性试剂的背景下，新的突变的极端嗜热PTE作为生物清除剂的用途。
[0019] 本发明的另一个方面提供了包含新的突变的极端嗜热PTE的组合物，该组合物用 于治疗由使用AHL进行通讯的细菌所引起的疾病。表达细菌不仅涉及细菌，而且涉及古细 菌。
[0020] 本发明的主题是具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE，其由对应于SEQ ID NO: 1 的共有序列或者与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少70%或更高的一致性的极端嗜热磷 酸三酯酶衍生得到，所述突变的PTE包含选自以下的至少一个突变，其中SEQ ID NO: 1中的 以下位置处的氨基酸被任何其他的天然或非天然的氨基酸取代：
[0021] -位置9处的甘氨酸G的取代，
[0022] -位置10处的甘氨酸G的取代，
[0023] -位置29处的亮氨酸L的取代，
[0024] -位置48处的亮氨酸L的取代，
[0025] -位置56处的天冬酰胺N的取代，
[0026] -位置69处的亮氨酸L的取代，
[0027] -位置70处的苏氨酸T的取代，
[0028] -位置74处的异亮氨酸I的取代，
[0029] -位置78处的缬氨酸V的取代，
[0030] -位置85处的丙氨酸A的取代，
[0031] -位置99处的酪氨酸Y的取代，
[0032] -位置101处的酪氨酸Y的取代，
[0033] -位置121处的缬氨酸V的取代，
[0034] -位置124处的异亮氨酸I的取代，
[0035] -位置132处的天冬酰胺N的取代，
[0036] -位置143处的天冬氨酸D的取代，
[0037] -位置166处的天冬氨酸D的取代，
[0038] -位置169处的异亮氨酸I的取代，
[0039] -位置193处的天冬氨酸D的取代，
[0040] -位置195处的丙氨酸A的取代，
[0041] -位置225处的精氨酸R的取代，
[0042] -位置227处的甘氨酸G的取代，
[0043] -位置228处的亮氨酸L的取代，
[0044] -位置230处的异亮氨酸I的取代，
[0045] -位置231处的酪氨酸Y的取代，
[0046] -位置232处的亮氨酸L的取代，
[0047] -位置259处的酪氨酸Y的取代，
[0048] -位置260处的半胱氨酸C的取代，
[0049] -位置261处的脯氨酸P的取代，
[0050] -位置262处的苏氨酸T的取代，
[0051] -位置263处的异亮氨酸I的取代，
[0052] -位置264处的天冬氨酸D的取代，
[0053] -位置265处的色氨酸W的取代，
[0054] -位置266处的酪氨酸Y的取代，
[0055] -位置267处的脯氨酸P的取代，
[0056] -位置268处的脯氨酸P的取代，
[0057] -位置269处的谷氨酸E的取代，
[0058] -位置270处的缬氨酸V的取代，
[0059] -位置271处的缬氨酸V的取代，
[0060] -位置272处的精氨酸R的取代，
[0061] -位置273处的丝氨酸S的取代，
[0062] -位置274处的苏氨酸T的取代，
[0063] -位置275处的缬氨酸V的取代，
[0064] -位置276处的脯氨酸P的取代，
[0065] -位置277处的天冬氨酸D的取代，
[0066] -位置278处的色氨酸W的取代，
[0067] -位置279处的苏氨酸T的取代，
[0068] -位置280处的蛋氨酸M的取代，
[0069] -位置281处的苏氨酸T的取代，
[0070] -位置282处的亮氨酸L的取代，
[0071] -位置283处的异亮氨酸I的取代，
[0072] -位置284处的苯丙氨酸F的取代，
[0073] -位置285处的谷氨酸E的取代，
[0074] -位置297处的苏氨酸T的取代，
[0075] -位置299处的谷氨酸E的取代。
[0076] PTE是最初被鉴定为能够水解含磷酸三酯酶的有机磷化合物的锌-金属蛋白酶， 但是最近发现该家族的更多成员还具有内酯酶活性。内酯酶活性能够水解在内酯环中结合 的酯。
[0077] 表述"具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE"涉及具有内酯酶和磷酸三酯酶催化 活性的任何酶，所述的酶是从属于PLL或PTE超级家族的嗜热或极端嗜热细菌分离的。"超 级家族"是指共有相同的折叠（拓扑结构和二级结构元件）以及相同的活性位点结构的一 大类蛋白质。超级家族由共有相同的三维结构和功能的几大类蛋白质组成，每类都展现出 不同的功能。这些功能通常共有共同的元件（例如在酶催化作用中重要的化学步骤），还具 有形成该元件的活性位点的残基。"嗜热细菌"是指在45°C至120°C之间生活的细菌。"极 端嗜热细菌"是指其最佳温度高于80°C的细菌。从嗜热或极端嗜热细菌分离的酶的热稳定 性赋予它们以廉价生产的优点，一方面是因为它们在有机溶剂中是稳定的（其使得它们更 适用于工业过程），另一方面是因为通过加热细胞（生产上述的酶）的细胞裂解物的技术它 们可以极为廉价地纯化，因此在一个阶段中获得高的产率和高的纯度。
[0078] 根据本发明试验部分公开的方法，可以在各自的底物上检验内酯酶和磷酸三酯酶 的催化活性。
[0079] 值得注意的是，由于在用于构建突变的极端嗜热PTE的载体的克隆位点中对限制 性内切酶进行选择，所以由实验方案，在SEQ ID N0:1的位置2处引入氨基酸残基，用于形 成不同的突变的极端嗜热PTE。例如在所述载体的克隆位点使用NcoI限制性内切酶，使得 在SEQ ID NO: 1的位置2处加入丙氨酸残基，以避免阅读框改变。在SEQ ID NO: 1的位置 2处引入所述丙氨酸残基在野生型或突变的极端嗜热PTE的活性中没有作用。这意味着具 有由SEQ ID NO: 1衍生的序列的2种突变的极端嗜热PTE在性能方面确切地具有相同的酶 活性，其中一种突变的极端嗜热PTE在位置2处具有加入的丙氨酸残基，另一种突变的极端 嗜热PTE在位置2处不含所述的丙氨酸残基。
[0080] 本发明具有内酯酶活性的突变的极端嗜热磷酸三酯酶（PTE)具有比衍生其的具 有内酯酶活性的野生型极端嗜热磷酸三酯酶（PTE)更高活性的优点，不仅是在水解OP的背 景下，还是在治疗由使用AHL进行通讯的细菌所导致的疾病（值得注意的是水解AHL)的背 景下。
[0081] 此外，本发明具有内酯酶活性的极端嗜热PTE在以下背景下还具有比衍生其的野 生型极端嗜热PTE更高活性的优点：
[0082] -在水解OP的背景下，和/或
[0083] -在群体淬灭的背景下，即，在抵抗病原体感染的背景下。
[0084] 术语"天然氨基酸"为由任何有机体的遗传密码所编码的氨基酸（也称为氨基酸 残基）。天然氨基酸为蛋白质的构件。存在有20种标准的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨 酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
[0085] 术语"非天然氨基酸"是指不是通过标准的细胞机器直接生产的合成氨基酸残基。 此外，它们还被本领域的技术人员称为合成氨基酸残基。这些氨基酸通常得自蛋白质的翻 译后修饰。
[0086] 在更具体的实施方案中，根据本发明的上述具有内酯酶活性的突变的极端嗜热 PTE (对应于SEQ ID NO: 1的共有序列，或者与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少70%或 更高的一致性）包含单一的突变，所述的突变选自以下，其中SEQ ID NO: 1中的以下位置处 的氨基酸被任何其他的天然或非天然的氨基酸取代：
[0087] -位置9处的甘氨酸G的取代，
[0088] -位置10处的甘氨酸G的取代，
[0089] -位置29处的亮氨酸L的取代，
[0090] -位置48处的亮氨酸L的取代，
[0091] -位置56处的天冬酰胺N的取代，
[0092] -位置69处的亮氨酸L的取代，
[0093] -位置70处的苏氨酸T的取代，
[0094] -位置74处的异亮氨酸I的取代，
[0095] -位置78处的缬氨酸V的取代，
[0096] -位置85处的丙氨酸A的取代，
[0097] -位置99处的酪氨酸Y的取代，
[0098] -位置101处的酪氨酸Y的取代，
[0099] -位置121处的缬氨酸V的取代，
[0100] -位置124处的异亮氨酸I的取代，
[0101] -位置132处的天冬酰胺N的取代，
[0102] -位置143处的天冬氨酸D的取代，
[0103] -位置166处的天冬氨酸D的取代，
[0104] -位置169处的异亮氨酸I的取代，
[0105] -位置193处的天冬氨酸D的取代，
[0106] -位置195处的丙氨酸A的取代，
[0107] -位置225处的精氨酸R的取代，
[0108] -位置227处的甘氨酸G的取代，
[0109] -位置228处的亮氨酸L的取代， [0110]-位置230处的异亮氨酸I的取代，
[0111] -位置231处的酪氨酸Y的取代，
[0112] -位置232处的亮氨酸L的取代，
[0113] -位置259处的酪氨酸Y的取代，
[0114] -位置260处的半胱氨酸C的取代，
[0115] -位置261处的脯氨酸P的取代，
[0116] -位置262处的苏氨酸T的取代，
[0117] -位置263处的异亮氨酸I的取代，
[0118] -位置264处的天冬氨酸D的取代，
[0119] -位置265处的色氨酸W的取代，
[0120] -位置266处的酪氨酸Y的取代，
[0121] -位置267处的脯氨酸P的取代，
[0122] -位置268处的脯氨酸P的取代，
[0123] -位置269处的谷氨酸E的取代，
[0124] -位置270处的缬氨酸V的取代，
[0125] -位置271处的缬氨酸V的取代，
[0126] -位置272处的精氨酸R的取代，
[0127] -位置273处的丝氨酸S的取代，
[0128] -位置274处的苏氨酸T的取代，
[0129] -位置275处的缬氨酸V的取代，
[0130] -位置276处的脯氨酸P的取代，
[0131] -位置277处的天冬氨酸D的取代，
[0132] -位置278处的色氨酸W的取代，
[0133] -位置279处的苏氨酸T的取代，
[0134] -位置280处的蛋氨酸M的取代，
[0135] -位置281处的苏氨酸T的取代，
[0136] -位置282处的亮氨酸L的取代，
[0137] -位置283处的异亮氨酸I的取代，
[0138] -位置284处的苯丙氨酸F的取代，
[0139] -位置285处的谷氨酸E的取代，
[0140] -位置297处的苏氨酸T的取代，
[0141] -位置299处的谷氨酸E的取代。
[0142] 本发明的更具体的主题是上述具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE，其由对应 于SEQ ID N0:3序列的Vulcanisaeta moutnovskia的极端嗜热内酯酶衍生得到的，该SEQ ID NO:3的序列属于SEQ ID NO: 1的共有序列，其中位置2处的氨基酸从SEQ ID NO:3缺 失。
[0143] 在优选的实施方案中，在根据本发明的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE 中，其中SEQ ID NO: 1中位置2处的氨基酸缺失，并且对应于SEQ ID NO: 3 (所述的SEQ ID N0:3衍生自Vulcanisaeta moutnovskia的极端嗜热内酯酶）或者与SEQ ID N0:3的氨基 酸序列具有至少70%或更高的一致性，所述突变的PTE包含选自以下的至少一个突变，其 中SEQ ID NO:3中的以下位置处的氨基酸被任何其他的天然或非天然的氨基酸取代： [0M4]-位置8处的甘氨酸G的取代，
[0145] -位置9处的甘氨酸G的取代，
[0146] -位置28处的亮氨酸L的取代，
[0147] -位置47处的亮氨酸L的取代，
[0148] -位置55处的天冬酰胺N的取代，
[0149] -位置68处的亮氨酸L的取代，
[0150] -位置69处的苏氨酸T的取代，
[0151] -位置73处的异亮氨酸I的取代，
[0152] -位置77处的缬氨酸V的取代，
[0153] -位置84处的丙氨酸A的取代，
[0154] -位置98处的酪氨酸Y的取代，
[0155] -位置100处的酪氨酸Y的取代，
[0156] -位置120处的缬氨酸V的取代，
[0157] -位置123处的异亮氨酸I的取代，
[0158] -位置131处的天冬酰胺N的取代，
[0159] -位置142处的天冬氨酸D的取代，
[0160] -位置165处的天冬氨酸D的取代，
[0161] -位置168处的异亮氨酸I的取代，
[0162] -位置192处的天冬氨酸D的取代，
[0163] -位置194处的丙氨酸A的取代，
[0164] -位置224处的精氨酸R的取代，
[0165] -位置226处的甘氨酸G的取代，
[0166] -位置227处的亮氨酸L的取代，
[0167] -位置229处的异亮氨酸I的取代，
[0168] -位置230处的酪氨酸Y的取代，
[0169] -位置231处的亮氨酸L的取代，
[0170] -位置258处的酪氨酸Y的取代，
[0171] -位置259处的半胱氨酸C的取代，
[0172] -位置260处的脯氨酸P的取代，
[0173] -位置261处的苏氨酸T的取代，
[0174] -位置262处的异亮氨酸I的取代，
[0175] -位置263处的天冬氨酸D的取代，
[0176] -位置264处的色氨酸W的取代，
[0177] -位置265处的酪氨酸Y的取代，
[0178] -位置266处的脯氨酸P的取代，
[0179] -位置267处的脯氨酸P的取代，
[0180] -位置268处的谷氨酸E的取代，
[0181] -位置269处的缬氨酸V的取代，
[0182] -位置270处的缬氨酸V的取代，
[0183] -位置271处的精氨酸R的取代，
[0184] -位置272处的丝氨酸S的取代，
[0185] -位置273处的苏氨酸T的取代，
[0186] -位置274处的缬氨酸V的取代，
[0187] -位置275处的脯氨酸P的取代，
[0188] -位置276处的天冬氨酸D的取代，
[0189] -位置277处的色氨酸W的取代，
[0190] -位置278处的苏氨酸T的取代，
[0191] -位置279处的蛋氨酸M的取代，
[0192] -位置280处的苏氨酸T的