用于筛选对复制禽病毒受纳的细胞系的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于从禽胚胎干细胞筛选对复制禽病毒受纳的细胞系的方法。
【背景技术】
[0002] 引言
[0003] 家禽农场受几种病毒疾病的影响或威胁，其影响可是直接的（病毒诱导的病理） 或者间接的（为其他病毒、细菌或寄生虫感染打下基础的免疫抑制）。
[0004] 接种疫苗广泛应用于主要的每年供应的禽类（鸡、火鸡、珍珠鸡、鹌鹑、鹅、 鸭……），然而造成了两个难题：
[0005] ?疫苗的生产成本必须与农业保持匹配，对农民仅产生低的利润空间。尽管在接种 疫苗的个体方面市场是相当大的（例如，在法国2011年4. 4千万产蛋母鸡），然而疫苗仅能 以超过几欧分/剂量的价格销售。
[0006] ?必须确保生物安全，特别是在减毒活疫苗的使用中潜在的病原菌污染的载体。应 召回接种了疫苗的饲养动物，并且在筛选金字塔（pyramide de selection)的顶部的意外 污染，对整个生产链具有巨大的影响。
[0007] 在许多病毒起源的病理中，马立克氏病（Marek's Disease-MD)是一种影响鸡的T 细胞的感染性淋巴组织增生疾病。MD的临床表现主要影响母鸡（原鸡（Gallus gallus))， 但是其它来自鸡形目（Galliformes)的鸟类同样可被感染并显现症状（鹌鹑或火鸡）。在 60年代，这种疾病作为对世界家禽养殖的主要限制逐渐出现。马立克氏病被认为是产蛋母 鸡的第二感染性疾病，据估算有10亿美元/年的总体影响，这些损失与病理和接种疫苗的 成本有关（FA0数据，2002)。
[0008] 马立克氏病是由一种疱疹病毒所导致，所述的疱疹病毒是马立克氏病毒属 的α-疱疹病毒科的亚家族，被称为马立克氏病病毒（le virus de la maladie de marek，MDV)或禽疱疼病毒 2 型（Gallid herpesvirus type 2，GaHV-2)。马立克氏病 毒属包括其他四种禽病毒：禽疱疹病毒3型（GaHV-3)、更为特异地影响火鸡的吐绶鸡疱 疹病毒（Meleagrid herpesvirus，MeHV-HVT代表火鸡疱疹病毒）、特别地影响鸽形目 (Columbiformes)的鹤疱疼病毒 1 型（Colombid herpesvirus 1，CoHV-1)、以及特别地影响 鸭科（anatidae)(鸭、鶴）的鸭疱疼病毒 1 型（Anatid herpesvirusl，AHV-1)。
[0009] MDV通过健康的动物与感染的鸡的直接接触，或者通过暴露于来自感染的动物的 皮肩碎片所污染的处所、落物、灰尘，在家禽农场中迅速传播。在呼吸道发生病毒的进入，其 中肺B淋巴细胞在疾病的进展中发挥重要的作用。
[0010] 在20世纪90年代出现与高致病性病毒的出现相关的这种疾病极其急性的形式。
[0011] 自70年代以来，疫苗提供了在家禽农场中控制马立克氏病的可能性。仅活疫苗有 效，并且存在两种类型的疫苗，它们通过减毒GaHV-2 (同源的）或者衍生自天然的致病性 (apathogfenes)株MeHV-I或GaHV-3 (异源的）所获得。衍生自MeHV-I的疫苗制剂卵内施用 于17 - 18日龄的胚胎，且同源的疫苗注射至在孵化中的小鸡。GaHV-2病毒的感染度与活的 受感染细胞相关：在上清液中和细胞裂解液中，检测不到的游离的病毒颗粒（Churchill， 1968)。因而，GaHV-2感染的传播需要在体外使感染的细胞与初始细胞共培养，或者在体内 通过注射至动物施用活的感染的细胞。因此，目前的GaHV-2疫苗由培养或冷冻细胞中感染 的细胞组成。
[0012] 现有技术
[0013] 病毒和细胞之间的关系只能使用所谓的受纳细胞进行研究，且对于MDV，复制局限 于禽细胞。当细胞允许病毒增殖并且产生新的感染性病毒颗粒时，则它被称为是受纳的。细 胞的基因型和分化状态是决定细胞对病毒感染的受纳性的两个主要因素。
[0014] 目前，细胞培养中马立克氏病毒的传播限制于原代或二代取出的禽细胞。目前 在四种不同细胞类型中获得了令人满意的复制水平：鸡胚成纤维细胞（CEF)、鸭胚成纤维 细胞（DEF) (Solomon等人，1968)、鸡肾细胞（CKC) (Churchill, 1968)、或者鸡胚皮肤细胞 (CESkC) (Dorange 等人，2000)。
[0015] 少量允许禽病毒的有效复制的受纳禽细胞系，为科学家和实业家、疫苗生产者带 来了难题。
[0016] 该问题由对马立克氏病毒的极其敏感性（acuit6)引起，迄今没有可用的未 转变的禽细胞系以允许所有的马立克氏病毒有效复制，即生产。因此，疫苗仍然完全 (exclusivement)通过在培养胚胎细胞、或通过酶解鸟（鸡形目或雁形目）取出的器官所获 得的原代禽细胞上生产。这需要承担巨大的成本，生产工序和复杂的控制以允许确保每一 生产周期中不存在污染物质。到目前为止，已证明使用从器官或胚胎取出的细胞分离细胞 系的试验不是很有成效。
[0017] 目前，仅有一个衍生自DF-I系（JB-Jl)的系似乎能实现病毒疫苗的工业化生产的 基本标准（Geerligs等人2008)，没有证明该系可以用作基底（substrat)用于复制不"适 应"细胞培养的病毒（在感染的动物上恢复"野生"病毒）。对于这些"野生"病毒，唯一报 告的结果涉及使用过表达病毒糖蛋白基因 gE的鹌鹑转化的细胞系（QM7) (Schumacher等 人，2002)。这些称为SOgE的细胞支持病毒MDV-I株生长，生长水平与在胚胎细胞的原代培 养上所观察到的水平相当。然而，这最后一个细胞系衍生自转化的细胞系，即在动物内能够 无限增殖，与永生化过程相关的潜在的肿瘤生产能力；因此使用这类细胞制备旨在注射至 鸡的疫苗制剂具有危险，因为其增殖不被控制。此外，SOgE细胞是经基因修饰的生物体，它 的使用是严格规范的，并且可能不允许在疫苗制剂中使用。
[0018] 应该注意的是，如文件W098/006824中所述的，DFl细胞（以及从其衍生的JB -Jl)通过从孵育10天的胚胎所获得的原代胚胎成纤维细胞的自发性建立所获得。这些细胞 因此衍生自已经参与分化途径的体细胞。
[0019] 以同样的方式，在专利申请EP 775746中所述的CHCC-0U2细胞是衍生自孵育数 日的胚胎细胞。如Ogura和Fujiwara的公开中所述的（1987)，这些细胞通过永生化作用 构建成系，所述的永生化作用使用N-甲基-Ν' -硝基N-亚硝基胍（N-Methyl-N' -nitro N-nitrosoGuanidine，MNNG)对原代细胞进行化学处理。这类处理对于禽细胞的作用是已 知的，并且导致永生化系的获得，但其具有致癌特性。因此，例如同样通过化学处理获得的 鹌鹑成纤维细胞QT6具有肿瘤形成特性（Moscovici等人，1977)。
[0020] 此外，没有建立在复制马立克氏病毒中CHCC-0U2细胞的受纳性。在目前的情况 下，CHCC-0U2细胞没有形成列为马立克氏病毒受纳的系统。此外，在专利申请EP 775743 中，CHCC-0U2的衍生系是使用MDV病毒长期感染的系，并且不是对复制马立克氏病毒受纳 的细胞系。
[0021] 以同样的方式，Lee等人（2013)描述了通过已孵育的胚胎的肝细胞的永生化所 获得细胞，如获得LMH系，其本身衍生自化学处理之后所建立的胚胎肝细胞（Kawaguchi等 人，1987)。如同QT6细胞的情况，这些细胞为强致癌性。它们并不像成纤维细胞所述的， 并且不受纳或不是很受纳马立克氏病毒（感染滴度=10空斑形成单位（unit6s formant plaques，ufp)对比ES⑶L-I的500, 000):因此，它未建立能够真正复制病毒的细胞，剩余的 IOufp可能由于与CEL. im.细胞共培养中DF-I细胞的存留（persistance)(由感染的细胞 组成的病毒接种物）所导致。
[0022] 最后，专利申请EP 2 572 728中所述的EB66细胞实际起源于胚胎，如同cES细胞 作为本发明的ES⑶Ll细胞的起源。然而，它们保留了 ES细胞的特征，尤其是表达标志物 CP0UV/0CT4和NAN0G。此外，这些EB66细胞不受纳马立克氏病毒。
【发明内容】
[0023] 本发明涉及一种允许获得对禽病毒的复制受纳的非转化的细胞系方法，所述的细 胞系可用于疫苗制剂。
[0024] 本发明涉及一种用于诱导禽干细胞分化的方法，其导致获得衍生自胚胎干细胞 (ES)的非转化的系，不再表达干细胞的特征标志物（cPOUV和NAN0G)，建立后在超过至少60 代具有稳定的表型，并且允许禽病毒的复制。
[0025] 所述的方法至少包括以下步骤：
[0026] a)存在基质（stroma)时，将禽胚胎干细胞培养至少三天；
[0027] b)在低血清浓度介质中将来自步骤a)、或c)、或d)之一的细胞培养至少两天；
[0028] c)在含 1 至 IOmM 的六亚甲基二乙酰胺（hexam0thyl6ne bisac0tamide，HMBA)的 低血清浓度介质中将来自步骤a)、或b)、或d)之一的细胞培养至少2天；
[0029] d)在低血清浓度介质中将来自步骤a)、或b)、或c)之一的细胞培养至少10天；
[0030] e)培养或冷冻步骤a)、b)、c)和d)中所得的允许禽病毒复制的禽细胞系。
[0031] 本发明还涉及按上述的方法所获得的细胞系，以及其作为基底用于禽病毒的体外 生产的用途。
[0032] 本发明还涉及上述细胞系作为基底用于体外生产禽病毒或用于滴定禽病毒的用 途。
[0033] 此外，本发明的另一个目的涉及一种用于体外制备疫苗制剂的方法，所述的方法 包括培养上述的系，并且使用至少一种禽病毒感染，还涉及疫苗制剂，严格地说，所述的疫 苗制剂包括感染有至少一种禽病毒的上述的细胞系。
[0034] 发明详述
[0035] 本发明涉及一种用于获得允许在体外复制禽病毒的未转化的禽细胞系的方法，其 至少包括以下步骤：
[0036] A)存在基质时，将禽胚胎干细胞培养至少三天；
[0037] B)在低血清浓度介质中培养至少两天；
[0038] C)在含1至IOmM的六亚甲基二乙酰胺（HMBA)的低血清浓度介质中培养至少两 天；
[0039] D)在低血清浓度介质中培养至少10天；
[0040] E)培养或冷冻允许禽病毒复制的禽细胞系。
[0041] 根据本发明的方法具有禽胚胎干细胞（ES细胞）作为"原产品"、或起始细胞或原 始细胞，具体地如Lavial等人2007所述的表达标志物cPOUV和NAN0G。
[0042] 被暴露于降低的血清浓度的禽ES细胞的分化表现为形态学变化（细胞大小的增 加以及细胞质/细胞核比例的增加），并且对"适应"在细胞上进行培养的病毒获得低受纳 性。
[0043] 根据基于暴露于至少一种细胞外基质复合物和HMBA的细胞分化作用的诱导逻辑 (logique d' induction)，实施从禽ES细胞建立受纳的系。
[0044] 本发明提供了获得对禽病毒的复制受纳的细胞（尤其包括CHCC-0U2细胞）的可 能性，与现有技术的细胞不同，所述的细胞建立成系不依靠致癌剂导致的转化，或者通过例 如化学试剂的外部试剂的方式永生化方法。本发明的细胞通过分化建立，尤其通过细胞分 化化学处理（HMBA)的方法，且不通过转化或永生化。因此，这些受纳细胞的建立为非自发 的，与现有技术中的某些细胞如DFl细胞不同，因为它们衍生自已建立的细胞（ES细胞）并 且不来自原代体细胞。
[0045] 定义
[0046] -般地，在本发明的范围内，"禽病毒的复制"的表述应被理解为病毒的有效和生 产性的复制的含义。因此，对于"对禽病毒的复制受纳的细胞系"意思是一种细胞系或细胞 能够完成病毒周期的全部步骤，导致由感染性病毒颗粒所组成的子代病毒的生产，以及尤 其是马立克氏病毒和双RNA病毒（Birnaviruses)(在马立克氏病毒的情况中，感染性病毒 颗粒与接种物中的细胞相关）。如上所述，受纳的细胞允许病毒的进入和生产性复制。对禽 病毒的复制的受纳性，在不同病毒间是可变的，本领域技术人员根据有关病毒能够理解不 同的情况。本领域技术人员将因此能够根据待测试的病毒的类型，对每一种原始颗粒确定 寻找复制因素。
[0047] 熟于细胞培养的本领域技术人员容易理解术语"在合适的介质中培养"。它是指在 体外、以及在合适的营养介质通常为液体中、在对细胞的生长优化的条件下（尤其是在