具有提高的病毒生产能力的细胞系及其生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及具有提高的病毒生产能力的细胞系及其制备方法，更具体地，涉及由于Bst-2(tetherin)基因的功能丧失而具有提高的病毒生产能力的细胞系以及其生产方法。
【背景技术】
[0002]流感是一种由流感病毒感染呼吸道所引起的急性发热性疾病。流感病毒根据它们的核心蛋白被分类为A、B和C型。A、B和C型流感的宿主之间在流行病学和临床特点上有所不同。流感病毒是具有80-120nm直径的球形病毒，并且基于病毒表面上的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)糖蛋白的抗原性质被分成各种亚型。在A型流感的情况中，已经鉴定出16种HA亚型(Hl至H16)和9种NA亚型(NI至N9)。因此，理论上存在144种A型流感病毒的亚型(例如，H1N1、H1N2 等)(Treanor J.J.et al., In Principles and Practice ofInfect1us Diseases, 2060-85，2005)。
[0003]流感疫苗包括灭活疫苗和活疫苗。灭活疫苗是通过纯化在含胚卵中培养的病毒，并将培养的病毒用福尔马林等灭活而产生的。灭活疫苗包括灭活的全病毒疫苗，通过用醚等破坏病毒包膜产生的裂解疫苗，通过纯化血凝素和神经氨酸酶组分获得的亚单位疫苗等。作为活疫苗，已经开发并使用活的减毒流感疫苗(LAIVs)。因为全病毒疫苗在婴儿中引起副作用，这些疫苗在包括韩国在内的许多国家几乎不使用，而仅在某些国家使用。然而，组分疫苗如裂解疫苗或亚单位疫苗是高度安全的并且具有公认的效果，因此被最频繁地使用。另外，已开发出含有用于增强免疫反应的免疫佐剂(如MF-59)的疫苗，或形成病毒样小泡的病毒体疫苗，并在一些国家中使用(Bridges C.B.et.al., InVaccines, 259-290，2008 ；Belshe R.B.et.al., In Vaccines, 291-309，2008)。
[0004]到现在为止，为了生产用于产生抗流感疫苗的病毒，使用将种子病毒接种到受精卵中并培养接种病毒的方法(韩国专利公开号10-2012-0103737A)。但是，这种方法由于包括供应受精卵的安全性、过敏诱发和病毒传播等问题而具有非常低的效率。为获得用于疫苗生产的特异性无病原体的受精卵，应该在与外界完全隔离的无菌设施中，在不向鸡施用抗生素和疫苗的状态下饲养鸡，并应从鸡生产受精卵。所产生的无病原体的卵在孵化所孵化约10天，在这之后由注射器针头或类似物将病毒接种到卵的胚胎或尿囊液。接种后培养接种病毒3天，然后回收培养的病毒并进行纯化处理。在某些情况下将这种程序制备的病毒进行灭活工艺，然后向其中加入用于诱导有效的免疫应答的佐剂、稳定剂、防腐剂等，由此生产疫苗。将所生产的疫苗装填到单个小瓶或注射器中，在这之后进行检查、包装和运输。在日本脑炎病毒的情况下，除了使卵受精并培养以外，也将该病毒接种到乳鼠的大脑中。
[0005]在这种传统的疫苗生产方法中，扩大生产设施很困难。例如，需要额外供给作为原料的受精卵，扩大使用受精卵的生产工艺，而对于这种供应，也应该扩大无病菌的养鸡设施。因为在这些设施中饲养的鸡免疫很弱，这些鸡比一般的鸡难以饲养，需要被彻底控制。因此，扩大这样的设施在空间或经济方面有许多限制。此外，当禽类传染性疾病如禽流感(Al)或新城疫(ND)流行时，还有可能难以稳定地供给无病原体的卵。
[0006]在尝试克服这种常规问题中，通过动物细胞培养来生产疫苗的方法很久前就受到关注(韩国专利公开号10-2012-0033334)。这些方法包括通过在无菌条件下培养大量动物细胞并用病毒感染培养的动物细胞来生产疫苗的方法，通过基因工程方法仅生产诱导抗体产生的抗原的方法，等。通过动物细胞培养来生产疫苗的方法的最大优点是可以扩大生产规模。具体而言，根据被用作用于疫苗生产原料的动物细胞的培养规模可以按需扩大生产规模。
[0007]然而，尽管有这样多的优点，通过动物细胞培养来生产疫苗并不容易实现。这是因为最初的投资太高，为顺利地进行该生产的个体基础设施是不够的，并且每单位体积的产率比现有的使用受精卵或动物的略低。为了克服在使用动物细胞来生产疫苗时每单位体积产量低的问题，做了一些尝试来使用基因工程技术开发优良的宿主动物细胞系(JangJ.et al., Appl.Microb1l.B1technol, 85:1509-1520，2010)，但这种尝试仍在不充分的水平。因此，为了优化病毒生产，需要产病毒细胞系的鉴定、培养条件的改善以及感染条件的改善。
[0008]目前典型的用于生产病毒疫苗的细胞系的例子包括:MDCK(来自Madin-Darby犬肾的细胞)，CRUCELL(荷兰)开发的PERC6 (来自通过插入人腺病毒5型的El基因而遗传修饰的人胚胎视网膜细胞的细胞)，VERO(来自在日本千叶县的千叶大学分离的非洲绿猴(Cercopithecus aeth1ps)肾脏的上皮细胞的细胞)，和BHK21 (从幼仓鼠肾细胞永生的细胞)。
[0009]同时，当病毒感染机体时，发生病毒在受感染细胞中的增殖，并且增殖病毒颗粒穿过细胞膜出芽而感染其他周围细胞。在细胞抵御病毒感染的防御机制部分中，Bst-2基因在细胞膜上表达。Bst-2在N末端和C末端两端具有细胞膜结合位点，并且因此在细胞膜中以中间被抬起的形式(像桥)表达。Bst-2的C末端位于细胞膜的脂筏区域，而N末端位于非脂筏区域。
[0010]尚不知晓固定到脂筏区域的C-末端区域的功能。同时，当病毒从脂筏区域出芽到细胞外时，Bst-2通过其固定到非脂筏区域的区域而抑制病毒颗粒穿过细胞膜。对于哺乳动物细胞的这种防御机制，一些病毒产生促进Bst-2基因降解的蛋白，以避免宿主细胞的这种机制。这矛盾地表明Bst-2基因的功能强烈地有助于抑制病毒生产。然而，并非所有病毒都有这个功能，一些病毒(特别是HIV病毒)具有由Vpu基因促进Bst-2基因降解的功能，而其他大多数病毒不具有靶向Bst-2基因的避免机制。
[0011]因此，为了有效地生产大量的病毒，并使用所产生的病毒用于疫苗生产，需要开发一种能灭活或抑制在动物细胞中的Bst-2基因功能以培养不促进Bst-2基因降解的病毒的技术。
[0012]因此，本发明人进行了广泛的努力来开发一种用于增加宿主细胞的病毒生产能力的方法，并且结果发现，当在细胞中丧失Bst-2基因功能时，可以生产由于促进病毒的胞外释放和减少细胞凋亡而具有增加的病毒生产能力的病毒生产细胞系，从而完成了本发明。
[0013]在【背景技术】部分公开的信息仅用于增强对本发明背景的理解，并因此可能不包含已被本领域的普通技术人员公知的形成现有技术的信息。
【发明内容】
[0014]本发明的一个目的是提供一种细胞凋亡被抑制的产病毒突变细胞系的方法。
[0015]本发明的另一个目的是提供一种具有增加的病毒生产能力的产病毒突变细胞系。
[0016]本发明的又另一个目的是提供一种使用具有增加的病毒生产能力的产病毒突变细胞系生产病毒的方法。
[0017]本发明的再另一个目的是提供一种使用具有增加的病毒生产能力的产病毒突变细胞系生产针对病毒疾病的疫苗的方法。
[0018]为了达到上述目的，本发明提供了一种细胞凋亡被抑制的产病毒突变细胞系，所述方法包括突变在生病毒细胞系中的Bst-2基因。
[0019]本发明还提供了一种产病毒突变细胞系，其在具有病毒生产能力的细胞系中缺乏Bst-2基因的功能，其中具有增加的病毒生产能力的产病毒突变细胞系缺乏所述Bst-2基因的功能。
[0020]本发明还提供一种产病毒突变细胞系，其中在产病毒细胞系中引入不表达Bst-2的突变的Bst-2基因，其中该突变细胞系因引入突变的Bst-2基因而具有增加的病毒生产能力。
[0021]本发明还提供了一种生产所需病毒的方法，该方法包括以下步骤:(a)用所需病毒感染具有增加的病毒生产能力的突变细胞系；和(b)培养被所需病毒感染的细胞系，然后离心培养物的上清液以回收所需病毒。
[0022]本发明还提供了一种用于生产针对病毒疾病的疫苗的方法，所述方法包括以下步骤:用所需病毒感染具有增加的病毒生产能力的突变细胞系；(b)培养被所需病毒感染的细胞系，然后离心培养物的上清液以回收所需病毒；和(C)衰减或灭活所回收的病毒。
[0023]本发明的其它的特征和实施例将从以下详细描述和所附权利要求中更加清楚。
【附图说明】
[0024]图1示出具有突变的Bst-2基因的MDCK细胞系的PCR(聚合酶链反应)产物通过电泳的结果。
[0025]图2示出具有突变的Bst-2基因的VERO细胞系的PCR产物通过电泳的结果。
[0026]图3示出进行菌斑测定法来测量野生型MDCK细胞和Bst_2突变的MDCK细胞系在病毒感染后得到的上清的滴度的结果。
[0027]图4示出进行菌斑测定法来测量野生型VERO细胞和Bst_2突变的VERO细胞系在病毒感染后得到的上清的滴度的结果。
[0028]图5示出通过稀释野生型MDCK细胞和Bst_2突变的MDCK细胞系，用病毒感染稀释细胞并培养病毒感染的细胞所获得的结果。
[0029]图6示出通过稀释野生型VERO细胞和Bst_2突变的VERO细胞系，用病毒感染稀释细胞并培养病毒感染的细胞所获得的结果。
[0030]图7示出Bst-2缺失细胞的细胞内信号减少。(A:用不同浓度的LPS处理的亚硝酸盐生产比较；和B:用LPS处理的NFKB磷酸化的比较)。
[0031]图8是一组照片，示出病毒感染后Bst-2缺失细胞的凋亡样态明显减少。(A:感染了 HlNl的Vero细胞系；和B:感染了 H3N2的Vero细胞系)。
[0032]图9示出进行磷脂酰丝氨酸(细胞凋亡指示剂)染色来观察病毒感染后在Bst-2缺失细胞中凋亡样态明显减少的现象的结果。(A:感染了 HlNl的Vero细胞系；和B:感染了 H3N2的Vero细胞系)。
[0033]图10示出进行Bst-2再次导入实验以证明胞质域参与细胞凋亡的结果。(A:再次导入Bst-2后的Bst-2表达的FACS分析；和B:感染MHV68病毒后细胞凋亡的比较)。
[0034]图11示出Bst-2突变的Vero细胞系的病毒生产能力由于其细胞凋亡减少而显著增加。
[0035]图12示出当在正常NIH/3T3细胞系中另外表达具有缺失的胞质域的Bst-2时，病毒生产增加。
[0036]图13示出使用B2K进行实验来证明Bst_2缺失的细胞系的病毒生产增加是由于细胞凋亡抑制的结果。
具体实施例
[0037]除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。通常，将在下面描述的、本文中使用的命名法和实验方法是本领域中公知且普遍采用的。
[0038]在本发明中，发现具有增加的病毒生产能力的细胞系可以通过在细胞中缺乏Bst-2基因的功能，使病毒从宿主