一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物动物细胞系领域，具体涉及一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系及其构建方法。
【背景技术】
[0002]经过20多年的发展，我国海水养殖取得重大成绩，养殖规模、品种和产量均居于世界前列，海水养殖产量在海洋渔业产量的比重从过去的10%上升到了目前的40%。鞍带石斑鱼(Epinephelus Lanceolatus)，又称龙胆石斑鱼，俗称龙胆，是我国一类重要海水养殖经济鱼类，由于其肉质鲜嫩、营养丰富，加之其生长快，适应性强，已成为我国南方海水养殖的重要对象。近年来，我国海水养殖业迅速发展的同时，也面临着基础研宄薄弱、病害发生频繁、抗病优良品种缺乏等突出问题，这已成为制约我国海水养殖产业健康可持续性发展的关键因素，尤其在面对由于病毒导致的爆发性流行病时，常常是束手无策。查清病毒的感染途径及病毒与细胞相互作用机理是从根本上预防和解决众多海洋经济鱼类病毒病的关键。细胞系是鱼类免疫学、功能基因组学和环境毒理学研宄的强有力的工具，也是研宄生物进化、发育和遗传的良好材料。同时，细胞系也是进行鱼类病毒学研宄，分离、鉴定鱼类病毒及研制病毒疫苗所必须的材料。
[0003]鱼类的细胞培养起始于20世纪60年代初，迄今为止，已经建立的鱼类细胞系多为淡水鱼类和溯河性鱼类，主要用于病毒学研宄，由海水鱼类建立的细胞系比较少。由于缺少敏感细胞系，海水鱼类病毒的分离、培养及疫苗的研制进展较慢，病毒在海水鱼类养殖过程中的感染、发病作用机理还无法进行深入研宄。病毒在体内外都有一定的细胞嗜性限制性。细胞表面受体的存在，往往决定着病毒的宿主范围和对组织及细胞的亲嗜性。此外，病毒增殖的各个过程，如吸附与入侵、脱壳、病毒成分的合成以及装配与释放等都受到细胞因素的影响，而且，病毒增殖本身就是一个极为复杂的过程。殷霞与刘景华在其主编的《动物病毒学》一书中指出，关于哪些类型的细胞对哪些种类的病毒具有敏感性，没有明确的规律性，似乎只能依靠经验，也就是通过实践来发现和验证。
[0004]鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性，所以有效的途径是以数量对质量，即制备各种鱼类各种组织的原代细胞，从中筛选出敏感的细胞系。鱼类的肾脏是参与体液免疫的重要器官，同时也是虹彩病毒、草鱼呼肠孤病毒、欧洲鳗麵病毒等众多鱼类病毒的重要靶器官。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，本发明以鞍带石斑鱼体肾组织为对象，成功建立了鞍带石斑鱼肾组织细胞系，为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供重要研宄平台和实验材料。同时，本发明建立的方法也可以应用于从其它鱼类富含血细胞组织中建立细胞系，如肝、脾等组织。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系，该鞍带石斑鱼肾组织细胞系的生物学名称为GGKD，该细胞系于2015年I月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为:中国.武汉.武汉大学，邮编:430072，保藏登记入册编号为CCTCC NO:C201516，请求保藏人为肇庆大华农生物药品有限公司。
[0007]本发明所述的一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系的构建方法，具体包括如下步骤:
[0008](I)肾组织的处理:取鞍带石斑鱼肾组织并进行消毒、切块，处理后浸泡待用；
[0009](2)原代培养:上述处理后的取鞍带石斑鱼肾组织经胰酶消化液消化后进行原代培养；
[0010](3)传代培养:原代培养细胞汇合度达60-90%时进行传代培养，每5-7天传代一次。
[0011]本发明所述的所述构建方法中，具体地，步骤(I)中肾组织的处理:将鲜活的鞍带石斑鱼于含有青霉素和链霉素的高双抗海水中充气暂养24小时，取鲜活鞍带石斑鱼，用酒精对鞍带石斑鱼进行消毒，无菌条件下解剖取肾组织，切块，浸泡于漂洗液进行漂洗。
[0012]优选地，所述的漂洗液为含有400IU/ml青霉素、400 μ g/ml链霉素的M199溶液。
[0013]本发明所述的所述构建方法中，具体地，所述步骤(2)中原代培养:将步骤(I)得到的肾组织加入胰酶消化液，在室温下消化20-30min，消化后收集细胞悬液；将细胞悬液加入l_2ml含血清培养液(含有400IU/ml青霉素、400 μ g/ml链霉素、5_10 %胎牛血清的M199溶液)终止消化，并过滤，吸取滤液离心，弃上清，沉淀中加入Iml基础培养液、9ml灭菌水，颠倒混匀后放置15-30s，裂解血细胞；然后加入Iml基础培养液，在100目灭菌滤网上过滤；滤过液离心，加入增值培养液重悬，重悬后，置于28°C恒温培养箱开始原代培养，每2-3天按半量换液方式更换培养液。
[0014]优选地，所述基础培养液为M199、MBl和L_15中的一种。
[0015]优选地，所述增值培养液为含有20%胎牛血清、0.046mM NaCl,400IU/ml青霉素、400 μ g/ml链霉素、20ng/ml表皮生长因子及20ng/ml成纤维细胞生长因子的M199培养液；或
[0016]含有20%胎牛血清、0.046mM NaCl,400IU/ml 青霉素、400 μ g/ml 链霉素、20ng/ml表皮生长因子及20ng/ml成纤维细胞生长因子的MEM培养液；或
[0017]含有20%胎牛血清、0.046mM NaCl,400IU/ml 青霉素、400 μ g/ml 链霉素、20ng/ml表皮生长因子及20ng/ml成纤维细胞生长因子的L-15培养液。
[0018]本发明所述的所述构建方法中，具体地，所述步骤(3)中传代培养:原代培养细胞长至汇合度达60-90%时，加入胰蛋白酶消化，用传代培养液悬起细胞，然后接种于培养瓶内在28°C培养箱中培养，每5-7天传代一次。
[0019]优选地，传代培养液为含有5-20%胎牛血清、0.046mM NaCl、100-400IU/ml青霉素、100-400 μ g/ml链霉素、0-20ng/ml表皮生长因子及0_20ng/ml成纤维细胞生长因子的M199培养液；或
[0020]含有5-20%胎牛血清、0.046mM NaCl、100_400IU/ml 青霉素、100-400 μ g/ml 链霉素、0-20ng/ml表皮生长因子及0_20ng/ml成纤维细胞生长因子的MEM培养液；或
[0021]含有5-20%胎牛血清、0.046mM NaCl、100_400IU/ml 青霉素、100-400 μ g/ml 链霉素、0-20ng/ml表皮生长因子及0_20ng/ml成纤维细胞生长因子的L-15培养液。
[0022]优选地，步骤(3)中传代传至第2代时，将培养液中成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的浓度降为8ng/ml ;传至第5-10代时，将培养液中胎牛血清浓度降为15%，成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的浓度降为4ng/ml，青霉素浓度降至100IU/ml、链霉素浓度降至100 μ g/ml ;传至第15-20代时，将培养液中成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的浓度降为零，胎牛血清含量降至8-10%。
[0023]实施本发明的鞍带石斑鱼肾组织细胞系及其构建方法，具有以下有益效果:
[0024](I)采用本发明的技术方案，对鞍带石斑鱼肾组织进行了原代及传代培养，取得了较好的培养效果，从而建立了鞍带石斑鱼肾组织细胞系，可连续传至65代。
[0025](2)细胞系可连续传代，因此能提供大量的鞍带石斑鱼肾组织来源细胞，且细胞增殖培养液配方简单，无需添加外源生长因子，传代细胞能维持良好的生长状态，并可对其进行冷冻保存。
[0026](3)