鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物细胞系技术领域，具体涉及一种鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系及其构建方法。
【背景技术】
[0002]鞍带石斑鱼(Epinephelus Lanceolatus)，又称龙胆石斑鱼，俗称龙胆，是石斑鱼类中体型最大的鱼类，有斑王之称。属鲈形目，鯧科，石斑鱼亚科，石斑鱼属。鞍带石斑鱼是我国一类重要海水养殖经济鱼类，由于其肉质鲜嫩、营养丰富，加之其生长快，适应性强，已成为我国南方海水养殖的重要对象。
[0003]近年来，随着养殖石斑鱼规模的不断扩大，集约化程度的不断提高，以及受养殖环境污染、管理技术措施相对滞后等诸多因素的影响，石斑鱼的病害也日益严重。石斑鱼疾病繁多，病原包括病毒、细菌、寄生虫等，尤其是由虹彩病毒、神经坏死病毒引起的病毒病最为严重，一旦暴发就会造成大规模死亡甚至全军覆没，每年因其造成的直接经济损失亿元以上，已经成为石斑鱼养殖业健康发展的重要制约因素之一。
[0004]查清病毒的感染途径及病毒与细胞相互作用机理是从根本上预防和解决石斑鱼等众多海洋经济鱼类病毒病的关键。细胞系作为一种体外培养系统，因其成本低、可重复性好、条件可控等优点，被广泛应用于病毒学、免疫学、毒理学、发育生物学、生理学、肿瘤学、基因组学、蛋白组学、遗传学等领域，尤其是在分离与培养病毒、研宄病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗方面是重要的工具。
[0005]鱼类是较低等的脊椎动物，生活在病原更为富集的水环境中。鱼类皮肤是机体与外界水环境接触的门户，也是阻止病原微生物进入体内的第一道防线。鱼类的皮肤发挥了屏障的作用并且可以分泌黏液等抗菌物质。对于大多数鱼类而言，并不像陆生脊椎动物一样皮肤表面存在角质化的死细胞，相反，鱼类的表皮几乎全部由活细胞组成。鱼类的皮肤一旦受到化学或机械等损伤后，细菌、病毒或其他病原体就可以快速在鱼类开放性伤口内生长或进入体内。如对海水鱼类危害较为严重的淋巴囊肿病毒，通过皮肤伤口、鰓或消化道入侵机体，在局部增殖，再通过血液循环到达其他靶器官。
[0006]显然，鱼类皮肤组织来源细胞是进行鱼类病毒分离、鉴定与繁殖，进而研宄鱼类病毒的致病机理、病毒宿主相互作用以及研制疫苗的良好材料。鱼类原代细胞系的构建技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性，所以构建一株需求鱼类细胞系有效的途径是以数量对质量，即制备大批量的原代细胞株，从而筛选出敏感的细胞系。
【发明内容】
[0007]为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系，该鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系具有传代稳定、存活率高的特点。
[0008]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0009]一种鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系，该鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的生物学名称为GGSK，该鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系于2015年I月29提交保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为:中国.武汉.武汉大学，邮编:430072，保藏登记入册编号为CCTCC No:C201515，保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学，邮编430072。
[0010]本发明的另一目的在于提供上述鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的构建方法，技术方案如下:
[0011 ] 一种鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的构建方法，该构建方法包括以下步骤:
[0012]I)组织取样:将鞍带石斑鱼鱼体消毒，无菌解剖，取皮肤组织，浸泡于漂洗液；
[0013]2)原代培养:将步骤I)浸泡后的皮肤组织切成1-5_2的小组织块，将上述小组织块接种于细胞培养瓶，28°C恒温于培养瓶壁干贴8-12h，加入培养液，开始组织细胞原代培养;
[0014]3)传代培养:原代培养细胞长至60-90%汇合度时，用胰酶在室温下消化，加入培养液进行传代培养。
[0015]作为优选，包括以下步骤:
[0016]I)组织取样:将健活鞍带石斑鱼鱼体用70-75%医用酒精进行消毒，置于超净工作台中，刮去鱼鳞，用灭菌解剖器械取其皮肤组织，浸泡于漂洗液；
[0017]2)原代培养:将步骤I)浸洗后的皮肤组织用漂洗液冲洗，锋利刀片切至1-5_2的小组织块，加贴块培养液浸没小组织块；将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，翻转瓶身28 °C恒温干贴8-12h，再加入2-3mL原代培养液，28 °C恒温培养箱开始原代培养，每4_6天更换培养液一次；
[0018]3)传代培养:原代培养细胞长至60-90%汇合度时，进行原代细胞的传代；用0.25%胰酶室温下消化2-3min，加入10_15mL原代培养液吹下贴壁细胞；将细胞悬液接种于2个培养瓶中28°C恒温培养箱培养，以后每5-7天米用传代培养液传代一次。
[0019]作为优选，步骤I)中，所述漂洗液包含基础培养基、400IU/mL青霉素、400 μ g/mL链霉素和800 μ g/mL制霉菌素，pH值7.2-7.4、且该基础培养基为M199培养液。
[0020]作为优选，步骤2)中，所述贴块培养液包括基础培养基、20-30 %胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、400IU/mL 青霉素、400 μ g/mL 链霉素，pH 值 7.2-7.4 ;该基础培养基为MEM或L-15或M199培养基。
[0021]作为优选，步骤2)和步骤3)中，所述原代培养液包括基础培养基、5-20%胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、400IU/mL 青霉素、400 μ g/mL 链霉素以及 10_20ng/mL 表皮生长因子，pH值7.2-7.4 ;该基础培养基为MEM或L-15或M199培养基。
[0022]作为优选，步骤3)中，所述传代培养液包括基础培养基、5-20%胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl,400IU/mL 青霉素、400 μ g/mL 链霉素以及 0_20ng/mL 表皮生长因子，pH值7.2-7.4 ;该基础培养基为MEM或L-15或M199培养基。
[0023]作为优选，步骤3)中，第2代至第5代时，传代培养液中含有15-20%胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl,400IU/mL青霉素、400 μ g/mL链霉素以及8ng/mL表皮生长因子。
[0024]作为优选，步骤3)中，第5代至15代时，传代培养液中含有15%胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、100IU/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素以及4ng/mL表皮生长因子。
[0025]作为优选，步骤3)中，第15代以后，传代培养液中含有8-10 %胎牛血清、0.04-0.05mM NaClUOOIU/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素，不含表皮生长因子。
[0026]相比现有技术，本发明的有益效果在于:
[0027]1.本发明以鞍带石斑鱼为对象，成功构建了鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系，该细胞系代传稳定，为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供重要研宄平台和实验材料；
[0028]2.本发明提供的鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的构建方法，采用贴块法，原代皮肤组织细胞迀出与增殖快；在传代过程中就其生长阶段调节培养液中的成分配比，以适合其传代生长，提高传代细胞的增殖性能和存活率，同时降低了培养成本；
[0029]3.本发明构建的鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系生长状态良好，以上皮样细胞为主要形态，细胞能稳定增殖，目前细胞已传至近60代；
[0030]4.本发明构建的鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系不同代次细胞冻存后复苏率为73% _88%，复苏细胞能够贴壁并生长分裂，并可以正常传代，细胞形态与增殖能力同冻存前无明显差异。
[0031]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0032]图1为鞍带石斑鱼皮肤组织块迀出细胞(标尺=100 μ m);
[0033]图2为鞍带石斑鱼皮肤组织第2代皮肤组织细胞(标尺=100 μ m);
[0034]图3为鞍带石斑鱼皮肤组织第17代皮肤组织细胞(标尺=100 μ m);
[0035]图4为鞍带石斑鱼皮肤组织第52代皮肤组织细胞(标尺=100 μ m);
[0036]图5为不同培养基对皮肤组织细胞生长的影响图；
[0037]图6为不同胎牛血清浓度对皮肤组织细胞生长的影响图；
[0038]图7为第44代皮肤组织细胞中期染色体分裂相；