A549-5Ps细胞系及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术，具体地，涉及稳定共表达甲型流感病毒RNA聚合酶 PB2、PB1、PA亚基和NP蛋白以及Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的细胞系及 其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 流感病毒是引起人类急性呼吸道传染病最主要的病原，主要通过空气飞沫传播， 具有传播速度快、发病率高和常常引发严重并发症等特点。流感每年在温带的秋冬季节大 量流行，造成相当高的发病率和死亡率，严重威胁人类健康。2009年，猪起源的甲型HlNl流 感在墨西哥出现第一例后迅速波及到全球214个国家和地区，仅在中国确诊病例高达12. 6 万例，死亡病例775例。而2013年在我国出现的H7N9禽流感病毒更是以相当高的死亡率 再次引起了对流感病毒高度的恐慌和关注。
[0003] 流感病毒属于正粘病毒科，分为甲、乙和丙三型。其中，甲型流感病毒危害最大，至 今为止的流感大流行都是由甲型流感病毒引发。甲型流感病毒基因组是由8节段单股负链 RNA组成。在每一节段上，一拷贝的流感RNA聚合酶与NP蛋白缠绕的负链vRNA形成一个 vRNP复合物，该复合物即为病毒基因组转录复制的最小单位。流感RNA聚合酶是由PB2、PB1 和PA亚基组成的异源三聚体，负责催化mRNA和vRNA的合成。在感染的细胞中，vRNP入核 后进行病毒基因组转录和复制。在核内，vRNA的5'和3'末端结合流感RNA聚合酶复合物 后激活病毒mRNA和cRNA的合成，再以cRNA作为模板合成vRNA。2005年Lutz等根据甲型 流感病毒基因组转录复制特点，首次将反义的萤火虫荧光素酶或绿色荧光蛋白编码基因替 换了流感NP节段的编码区，构建了流感RNA聚合酶特异启动的报告系统。此后，在细胞内 瞬时共表达该报告系统及流感PB2、PB1、PA和NP蛋白成为研究甲型流感病毒基因组转录 和复制过程的重要实验方法而被广泛使用。然而，瞬时共表达上述蛋白带来很多问题。瞬 时共表达不仅使得细胞间基因表达水平差异很大，而且每次实验受到细胞状态、转染效率 等因素影响，造成实验的可重复性差。另外，该系统建立的一个重要应用在于抗流感药物筛 选。瞬时共表达的方式在实验操作上包含了转染等步骤，实验成本和工作强度大，不适合应 用于高通量药物筛选。然而，稳定共表达的细胞系能够很好的克服上述缺点。2013年Ozawa 构建了首个稳定共表达流感PB2、PB1、PA和NP蛋白及嘌呤霉素抗性基因作为报告基因的 293细胞系，并且利用该细胞系筛选得到流感转录复制抑制剂，体现了此类细胞系的应用价 值。然而，该细胞系使用的报告基因是嘌呤霉素抗性基因，存在表型显现周期长，敏感度低 等问题。同时，293细胞系并非流感病毒感染的天然靶细胞，也进而产生了实验结果是否能 真实地反映自然生理过程等问题。
[0004] 在甲型流感病毒防治方面，抗原的漂移和变异严重限制了疫苗的保护作用。现已 批准上市的抗流感药物M2离子通道阻断剂和神经氨酸酶抑制剂针对的病毒靶点变异性较 强，致使病毒很快产生耐药性。因此，亟待寻找新的抗流感药物靶标和新型抗流感药物。在 流感病毒生活周期中，基因组的转录和复制是至关重要的过程。而在这一过程中发挥关键 作用的流感RNA聚合酶不仅具有高度的保守性而且是RNA依赖的RNA聚合酶，与宿主编码 的参与基因转录的DNA依赖的RNA聚合酶不同。这些特点使流感基因组转录和复制过程成 为极有前途的抗流感药物靶标。开发流感转录复制抑制剂成为抗流感药物研发的热点。
[0005] 在流感基因组转录复制过程中，除了病毒蛋白发挥作用外，还有大量的宿主因子 参与其中。研究这些宿主因子在流感基因组转录复制过程中发挥的作用有助于更深入理解 病毒的致病机理，为研发新的抗病毒药物提供新思路。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供稳定共表达甲型流感病毒 RNA聚合酶PB2、PB1、PA亚基和NP蛋白以及Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因 的细胞系及其构建方法与应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明首先提供了一种稳定共表达甲型流感病毒RNA聚 合酶PB2、PB1、PA亚基和NP蛋白以及Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的 A549-5PS细胞系，该细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简 称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码： 100101)，保藏日期为2013年9月30日，保藏编号为CGMCCNo. 8259。
[0008] 本发明还提供了一种稳定共表达甲型流感病毒RNA聚合酶PB2、PBUPA亚基和NP 蛋白以及Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的细胞系的构建方法，其是将编码 Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因和流感PB2、PBl、PA以及NP蛋白的基因分 别克隆至出发载体上，包括如下步骤：首先在A549细胞中转导能够同时表达Gaussia荧光 素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的慢病毒质粒pWPXLd-Gluc-IRES-blasticidin，然后将表 达流感PB2、PBUPA和NP蛋白的质粒共转导上述细胞；然后加入杀稻瘟菌素筛选后得到能 够稳定表达甲型流感病毒RNA聚合酶PB2、PB1、PA亚基和NP蛋白以及Gaussia荧光素酶 /杀稻瘟菌素抗性报告基因的多克隆细胞系；再经过单克隆化筛选，得到能够稳定高表达 Gaussia荧光素酶的A549-5PS细胞系。
[0009] 其中，所述A549细胞是A549-5PS细胞系的母本细胞，购自美国典型培养物保藏中 心（ATCC)，保藏编号为ATCC' CCL-185?。
[0010] 其中，所述编码流感PB2、PB1、PA和NP蛋白的基因来自甲型流感病毒毒株A/ WSN/33 (HlNl)0
[0011] 其中，所述出发载体为pWPXLd-puro。
[0012] Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的产生质粒是在慢病毒载体上构 建的同时表达Gaussia突光素酶和杀稻癌菌素抗性的质粒。该报告质粒中，Gaussia突 光素酶和杀稻瘟菌素抗性基因编码序列经由核糖体介入位点（IRES)分隔，组成Gaussia luciferase/IRSE/blasticidin单元。该结构单元外侧是流感NP节段的3'和5'非翻译 区（UTR)。上述结构倒装于人类I型启动子和鼠 I型终止子下。当报告质粒进入细胞后， 在人类I型RNA聚合酶的作用下转录出一条类似于病毒基因组RNA的负链RNA，经由流感 RNA聚合酶转录出正链mRNA，此时Gaussia荧光素酶和杀稻瘟菌素抗性才得以表达。其中， Gaussia荧光素酶作为报告基因检测流感转录复制活性，杀稻瘟菌素抗性基因用于维持细 胞系中各流感蛋白的表达。在该系统中，Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的 表达完全依赖于流感转录复制系统的活性。上述稳定的细胞系能够很好的模拟流感病毒感 染后病毒基因组在细胞内的转录复制情况。
[0013] 本发明还提供验证上述稳定共表达甲型流感病毒RNA聚合酶PB2、PBl、PA亚基和 NP蛋白以及Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的细胞系的方法。该细胞的总 RNA提取后进行RT-PCR，检测PB2、PB1、PA和NP基因 mRNA表达水平以及Gaussia荧光素酶 /杀稻瘟菌素抗性报告基因负链RNA表达。通过siRNA介导的基因沉默破坏该细胞系中流 感RNA聚合酶的表达，例如沉默PBl亚基表达，观察Gaussia荧光素酶蛋白的表达量变化。 另外，由于甲型流感病毒基因组转录复制过程中有大量的宿主因子参与，敲除已经确证的 参与其中的宿主因子，例如Tat-SFl和cyclinTl/⑶K9,观察Gaussia荧光素酶的表达量变 化。
[0014] 本发明还提供了前述稳定共表达甲型流感病毒RNA聚合酶PB2、PBUPA亚基和NP 蛋白以及Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的细胞系在高通量筛选甲型流感病 毒转录复制抑制剂中的应用。
[0015] 本发明还提供了前述稳定共表达甲型流感病毒RNA聚合酶PB2、PBUPA亚基和NP 蛋白以及Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的细胞系在筛选与甲型流感病毒相 互作用的宿主因子中的应用。
[0016] 本发明的有益效果在于：
[0017] 本发明是在流感病毒天然宿主细胞A549细胞基础上衍生出的细胞系，能够更真 实的反映流感病毒在人体内的复制情况。建立的稳定共表达的A549-5PS细胞系，其中使 用