专利名称：褐点石斑鱼鳍细胞系的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种利用褐点石斑鱼鳍组织细胞建立鳍细胞系的方法——褐点石斑鱼 鳍细胞系的构建方法。
背景技术：
褐点石斑鱼(i:/ /"e;^e/"sykscog"加m力是广泛分布于印度洋和太平洋的热带、亚 热带海域的一种具有较高经济价值的名贵海水养殖鱼类。近年来，我国的石斑鱼养殖 规模越来越大，但传染性病毒病也随之开始广泛传播，致使其死亡率逐年上升，造成 了重大的经济损失。査清鱼类病毒的感染途径和病毒与细胞的相互作用机理是从根本 上预防和解决石斑鱼等众多海洋经济鱼类病毒病的关键，而鱼类细胞系正是研究病毒 感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗的重要研究体系，也是该领域的研究热点和主 攻方向之一。
目前，还未有建立褐点石斑鱼组织细胞系的相关报道，也没有通过相应细胞系大 规模生产病毒疫苗的成功报道。显然，尽快建立褐点石斑鱼组织细胞系是为鱼类病毒 学等相关研究奠定基础，为鱼类病毒的分离、鉴定、繁殖、病毒疫苗制备以及病毒与 宿主细胞相互作用等研究创造条件，从而为石斑鱼养殖业带来巨大的经济效益是非常 必要的。
发明内容
本发明的目的就是利用褐点石斑鱼鳍组织，提供一种褐点石斑鱼鳍细胞系的构建 技术，以弥补现有技术的不足。
本发明的构建方法首先对鲜活褐点石斑鱼分别用浓度均为1000单位/毫升的青 霉素和链霉素的高双抗海水和75%酒精消毒处理，置于超净工作台中取下鳍组织，以 75%酒精再次消毒，磷酸缓冲液漂洗后剪成大致1 mm3的组织块；用浓度为0.5 %透 明质酸酶和0.2%11型胶原酶对鳍组织块联合消化1~2小时，并离心收集鳍组织块；用 含有5%胎牛血清和0.05^ 0.15。^的羧甲基壳寡糖的pH值为7.0-7.4的DMEM/F12培 养液充分悬浮，均匀接种于25毫升培养瓶中，24'C下正置干贴16~20小时后，每瓶 加入5毫升褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液，置22 24'C生化培养箱中培养，每隔 3~5天半量更换褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液一次；待褐点石斑鱼鳍细胞长成单 层后，使用浓度为0.1%~0.3%胰蛋白酶溶液消化，经褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液悬 浮后，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养。
所述的褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液配方为含有20%胎牛血清的pH值为 7.0~7.4的DMEM/F12培养液，并添加占该培养液0.05%。~0.15%)比例的羧甲基壳寡糖。
为了促进褐点石斑鱼鳍细胞的分裂和快速增殖，进一步又添加了 0.01%。~0.02%。的人碱 性成纤维细胞生长因子和0.02%。~0.04%。的I型人胰岛素样生长因子。
本发明的主要特点是细胞系可以连续传代，因此能提供出大量的褐点石斑鱼鳍 细胞；细胞系既可为鱼类病毒学等多种相关研究提供理想的体外研究，又可为鱼类病 毒提供一个理想的体外繁殖体系。经这种方法所构建的鳍细胞系现已传至第61代。
具体实施例方式
将上述本发明的方法按照基本步骤进行详述如下
1、 褐点石斑鱼鳍组织块的制备鲜活褐点石斑鱼于浓度均为1000单位/毫升的青 霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后于75%酒精中消毒1 2分钟。于超净工 作台中无菌取下鳍组织，再次用75 %酒精漂洗0.5 1分钟，用磷酸缓冲液漂洗2遍后 在含有5。/。胎牛血清的DMEM/F12培养液中，将鳍组织剪成约lmm3的组织块；800转 /分钟离心收集鳍组织块，加入0.5 %透明质酸酶和0.2 %11型胶原酶联合消化1~2小时； 1000转/分钟离心收集组织块；用含有5%胎牛血清和0.05%。~0.15%。的羧甲基壳寡糖的 pH值为7.0 7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于25毫升培养瓶中；将培 养瓶放入24'C培养箱中，正置干贴16 20小时。
2、 褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液的配制取常规配制的DMEM/F12培养液(pH 7.0-7.4) 3.0亳升，加入羧甲基壳寡糖0.15~0.3毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔 滤膜过滤除菌，加入1毫升胎牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至5.0毫升， 即为本发明的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液。
为了促进褐点石斑鱼鳍细胞的分裂和快速增殖，在上述专用培养液的基础上又添 加了 0.01%。~0.02%。的碱性成纤维细胞生长因子和0.02%。~0.04%。的人I型胰岛素样细胞 生长因子。
4、 褐点石斑鱼鳍细胞原代培养的启动将每瓶干贴后的鳍组织中加入5毫升的上 述专用培养液，于22 24'C培养；鳍细胞迁出后，每间隔3~5天，除去旧培养液，以 去除未贴壁的组织和死细胞，加入5毫升新鲜的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液；
5、 褐点石斑鱼鳍细胞的传代培养待褐点石斑鱼鳍细胞长成单层后，吸出培养瓶 中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.1%~0.3%的胰蛋白酶溶液，静置消 化0.5 1.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打 培养瓶底制成褐点石斑鱼鳍细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升鳍细胞悬液， 分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积 至5毫升；待褐点石斑鱼鳍细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例1
将鲜活褐点石斑鱼放入浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水 中暂养24小时后于75 %酒精中消毒2分钟，进行首次消毒；用棉球擦拭鱼体表后取冲液玻璃培养皿中，用镊子夹取浸有磷酸缓冲液的棉球顺 着鳍条的方向充分擦拭鳍组织，清除鳍组织表面黏液；再于75%酒精中漂洗1分钟， 进行二次消毒；将鳍组织用磷酸缓冲液漂洗2遍，充分洗去酒精后，转入含有5%胎牛 血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中剪成1立方毫米的组织块；800转/分钟离心收 集鳍组织块，加入0.5 %透明质酸酶和0.2 %11型胶原酶联合消化2小时；1000转/分 钟离心收集组织块；用含有5%胎牛血清和0.05%。的羧甲基壳寡糖的pH值为7.2的 DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于25平方厘米培养瓶中；将培养瓶放入22°C 培养箱中，正置干贴16小时。
取常规配制的DMEM/F12培养液(pH7.2) 3毫升，加入羧甲基壳寡糖0.3毫克， 完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入l毫升胎牛血清，补加常规配制的 DMEM/F12培养液至5.0毫升，即为褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液。在上述专用培养 液中又添加了 0.01%。人碱性成纤维细胞生长因子，更有利于褐点石斑鱼鳍细胞的分裂 和快速增殖。将每瓶干贴后的鳍组织中加入5毫升的上述专用培养液，于22'C培养； 鳍细胞迁出后，每间隔3天，除去旧培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入5 毫升新鲜的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液。待鳍细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培 养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.1%的胰蛋白酶溶液，静置消化1.5分钟； 吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐 点石斑鱼鳍细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升鳍细胞悬液，分别加入到新 的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待 褐点石斑鱼鳍细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例2
将鲜活褐点石斑鱼放入浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水 中暂养24小时后，于75 %酒精中消毒1.5分钟，进行首次消毒；然后将鱼转入超净 工作台中；用棉球擦拭鱼体表后取下鳍组织，置于盛有磷酸缓冲液玻璃培养皿中，用 镊子夹取浸有磷酸缓冲液的棉球顺着鳍条的方向充分擦拭鳍组织，清除鳍组织表面黏 液；再于75%酒精中漂洗0.5分钟，进行二次消毒；将鳍组织用磷酸缓冲液漂洗2遍， 充分洗去酒精后，转入含有5%胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中剪成1立 方毫米的组织块；800转/分钟离心收集鳍组织块，加入0.5%透明质酸酶和0.2%11型 胶原酶联合消化1.5小时；1000转/分钟离心收集组织块；用含有5%胎牛血清和0.1%> 的羧甲基壳寡糖的pH值为7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于25平方厘 米培养瓶中；将培养瓶放入24'C培养箱中，正置干贴20小时。
将每瓶干贴后的鳍组织中加入5毫升的pH值为7.4的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养 液，其中添加了 0.02%。的人碱性成纤维细胞生长因子和0.02%。的人I型胰岛素样细胞 生长因子，有利于褐点石斑鱼鳍细胞的贴壁、分裂和快速增殖。于24"C培养；鳍细胞 迁出后，每间隔4天，除去旧培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入5毫升新
鲜的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液；待褐点石斑鱼鳍细胞长成单层后，吸出培养瓶中 的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.3%的胰蛋白酶溶液，静置消化0.5分 钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5亳升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制 成褐点石斑鱼鳍细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升鳍细胞悬液，分别加入 到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升； 待褐点石斑鱼鳍细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例3
将鲜活褐点石斑鱼放入浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水 中暂养24小时后，于75 %酒精中消毒1分钟，进行首次消毒；然后将鱼转入超净工 作台中；用棉球擦拭鱼体表后取下鳍组织，置于盛有磷酸缓冲液玻璃培养皿中，用镊 子夹取浸有磷酸缓冲液的棉球顺着鳍条的方向充分擦拭鳍组织，清除鳍组织表面黏液； 再于75 %酒精中漂洗0.5分钟，进行二次消毒；将鳍组织用磷酸缓冲液漂洗2遍，充 分洗去酒精后，转入含有5%胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中剪成1立方 毫米的组织块；800转/分钟离心收集鳍组织块，加入0.5%透明质酸酶和0.2%11型胶 原酶联合消化1小时；1000转/分钟离心收集组织块；用含有5%胎牛血清和0.15%0的 羧甲基壳寡糖的pH值为7.2的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于25平方厘米 培养瓶中；将培养瓶放入24'C培养箱中，正置干贴18小时。
将每瓶干贴后的鳍组织中加入5毫升的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液，其中添加 了 0.01%。的人碱性成纤维细胞生长因子和0.04%。的人I型胰岛素样细胞生长因子，以 满足褐点石斑鱼鳍细胞的最佳增殖条件。24'C培养；鳍细胞迁出后，每间隔5天，除 去旧培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入5毫升新鲜的褐点石斑鱼鳍细胞专 用培养液；待褐点石斑鱼鳍细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶 中加入1毫升浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液，静置消化1分钟；吸去胰蛋白酶溶液， 将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼鳍细胞悬液； 从每个培养瓶中分别取出2.5毫升鳍细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养 瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼鳍细胞再次 长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养即可。
权利要求
1.一种褐点石斑鱼鳍细胞系的构建方法，首先对鲜活褐点石斑鱼分别用浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水和75％酒精消毒处理，置于超净工作台中取下鳍组织，以75％酒精再次消毒，磷酸缓冲液漂洗后剪成大致1mm3的组织块；用浓度为0.5％透明质酸酶和0.2％II型胶原酶对鳍组织块联合消化1～2小时，并离心收集鳍组织块；用含有5％胎牛血清和0.05‰～0.15‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于25毫升培养瓶中，24℃下正置干贴16～20小时后，每瓶加入5毫升褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液，置22～24℃生化培养箱中培养，每隔3～5天半量更换褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液一次；待褐点石斑鱼鳍细胞长成单层后，使用浓度为0.1％～0.3％胰蛋白酶溶液消化，经褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液悬浮后，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；所述的褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液配方为含有20％胎牛血清的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液，并添加占该培养液0.05‰～0.15‰比例的羧甲基壳寡糖。
2、如权利要求l所述的构建方法，其特征是在上述褐点石斑鱼鳍细胞专用 增殖培养液中又添加占该培养液0.01%。~0.02%。比例的人碱性成纤维细胞生 长因子和占该培养液0.02%。~0.04%。比例的I型人胰岛素样生长因子。
全文摘要
本发明涉及一种褐点石斑鱼鳍细胞系的构建方法，它是以褐点石斑鱼鳍组织为材料，采用浓度为0.5％透明质酸酶和0.2％Ⅱ型胶原酶联合消化法启动原代培养，在含胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、Ⅰ型胰岛素样生长因子和羧甲基壳寡糖的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；由本发明构建的褐点石斑鱼细胞系，目前已传至第61代，其工艺科学合理，可望应用于鱼类病毒的分离、鉴定、繁殖、病毒疫苗制备，以及病毒与宿主细胞相互作用等方面研究。
文档编号C12N5/06GK101372682SQ200810157499
公开日2009年2月25日 申请日期2008年10月15日 优先权日2008年10月15日
发明者姜国建, 杨洪收, 樊廷俊, 魏云波 申请人:中国海洋大学