专利名称：生产连续细胞系的方法
技术领域：
本发明涉及生产细胞系的方法。
背景技术：
细胞系已成为用于疫苗制造的有价值的工具。一些重要疫苗和病毒载体的生产 仍然在鸡胚或鸡胚原代成纤维细胞中进行。用于病毒复制的禽类原代组织由SPF(无特 定病原体)生产厂提供。SPF来源的组织昂贵，并且原料供应的质量通常难以控制。因 此，供应的不一致性和短缺是基于SPF蛋技术的最主要缺点。对于使用原代成纤维细胞 单层培养物的方法来说，同样也是这样。为了无限地增殖细胞系，需要将细胞永生化。 目前使用的大多数永生化细胞系是癌细胞或融合的杂交瘤细胞的后裔。但是，后一种技 术受到与骨髓瘤细胞融合的限制。不存在能够产生不同类型的永生化细胞的通用技术。发明简述本发明的目的是从不连续的细胞材料生产连续细胞。具体来说，目的是提供不 弓I入外来病毒基因的具有增殖潜力的连续细胞系。因此，本发明提供了一种用于生产连续细胞系的方法，所述方法包括提供动物 或人类的活细胞，用紫外光辐照所述细胞，增殖所述细胞，以及选择在至少20次传代后 能够增殖的细胞作为连续细胞系的细胞。这样的连续细胞系是能够增殖并用于生物分子例如蛋白质的重组表达，或用于 制造病毒产品例如病毒抗原或完整病毒群，特别是用于疫苗接种目的的细胞的培养物。因此，本发明还提供了一种生产病毒的方法，所述方法包括提供可通过本发明 的方法获得的连续细胞系的细胞，用所述病毒感染所述细胞，在所述细胞中增殖所述病 毒，以及收集所述病毒。另一方面，本发明提供了一种生产重组基因产物的方法，所述方法包括提供可 通过本发明的方法获得的连续细胞系的细胞，用编码所述基因产物的核酸转染细胞，表 达所述基因产物，以及任选地收集所述基因产物。另一方面，本发明提供了可以通过一种方法获得的连续细胞系，所述方法包括 提供动物或人类的活细胞，用有效剂量的紫外光辐照所述细胞，增殖所述细胞，以及选 择在至少20次传代后能够增殖的细胞作为所述连续细胞系的细胞。
图1显示了 UV处理步骤的流程。图2显示了鹌鹑的连续细胞培养物。图3显示了生产鹌鹑连续细胞系的系统树以及处理路线。图4显示了采用用于生产连续细胞的设置，UV剂量与辐照时间的相关性。发明详述本发明提供了通过细胞的UV处理来生产连续细胞系。细胞系是由原代细胞培养物的一个或多个传代培养物形成的细胞群。每轮传
3代培养被称为传代。当细胞被传代培养时，它们被称为已被传代。特定细胞群、或细 胞系，可以由它已被传代的次数来表征。原代培养物是细胞从组织分离后的第一代培养 物。在第一次传代培养后，细胞被描述为第二代培养物(一次传代)。在第二次传代培 养后，细胞变成第三代培养物(两次传代)，依此类推。本领域技术人员将会理解，在传 代期间可能存在多次群体加倍；因此，培养物群体加倍的数量大于传代次数。传代之间 的时间中细胞的扩增(即群体加倍的数量)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、基 底、培养基、生长条件和传代之间的时间。培养可以通过接种细胞培养基，使细胞生长 至细胞形成汇合细胞培养物或连续的膜，并用一部分汇合细胞接种新的细胞培养基来进 行。然而，传代是评估增殖能力的工具。一般来说，从组织分离到的细胞、包括未辐照 细胞，在它们达到不发生进一步增殖或细胞加倍的状态之前，能够传代约10-20次。然 后细胞进入衰老状态，不能从其获得进一步的传代培养。与此相反，连续细胞系在20次 以上传代之后、例如在 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、 50、55、60、65、70、75或80次以上传代之后能够增殖。现在，本发明人已经发现，这 种在第20次传代后能够传代多次的连续细胞、特别是永生化细胞，可以通过用UV处理 改变细胞、即通过用有效剂量的UV光辐照这些细胞来获得。本发明的术语“有效剂量 的UV光”是将非连续细胞系转化成连续细胞系所需的辐照的量。有效剂量的UV光的 范围，从这种转化所必需的最小剂量直到这些细胞所耐受的对细胞培养物整体没有致死 结果的最大剂量。显然，高于或低于有效剂量限度，不能获得连续细胞系。本领域技术 人员在本文中获得的信息和指导的基础上，经常规的最适化过程就能容易地确定每个细 胞系的最适有效剂量。细胞可以是原代细胞或几次传代后能够增殖的细胞。细胞系的培 养可以使用标准的细胞培养技术来进行，例如在T型瓶系统或转瓶系统中，或在搅拌釜 或其他生物反应器形式中。在本发明的几种实施方案中，培养物适合于并保持在无血清 条件下。在本申请中，术语“UV光”是指波长从10到400nm、特别是100到400nm的 紫外辐射。UV光可以选自UV C (100到280nm)、UV B (280到320nm)和UV A (320到 400nm)。在本发明的某些实施方案中，波长在200到300nm之间。可以使用光敏剂例 如嵌入到DNA中并被UV光活化的光敏剂来加速UV辐照的改变效应，尽管它们在本发 明的所有实施方案中不是必需的。在本发明的一个实施方案中，UV光是波长为约100到 约280nm的UV C。在本发明的另一个实施方案中，UV光具有约240到约290nm的波 长。在本发明的另一个实施方案中，约85%或85%以上的UV光具有约254nm的波长。不受任何理论的束缚，据信UV光改变细胞的遗传物质，这引入了突变。尽管 这样的改变一般能够被细胞的修复机制修复，但某些改变可能保留。这些改变能够引入 致死突变以及导致细胞永生化的变化。从UV辐照实验，可以选择导致显著部分的细胞 永生化并能够培养的最适剂量。在传代后，据信只有能够增殖的活细胞被选择，预计它 们仅具有少量变化，其中至少一个变化导致了永生化。显著部分的被辐照细胞将不被永 生化而是获得了不同的变化，产生凋亡或坏死的细胞。但是，原则上说，对于获得连续 细胞培养物来说，仅仅一个具有诱导永生化的变化的细胞就已足够，因为该细胞将通过 本文描述的多轮传代继续增殖和存活。UV光发射可以是连续形式的UV光发射例如汞灯技术，或脉冲式UV光例如单色激光技术。所需UV强度可以通过组合两个或以上灯来产生。至少两个辐照步骤可以 组合，其间具有暂停。本发明的主题包含任何有效剂量的UV光，即使细胞改变成连续 增殖的任何剂量的UV光。有效剂量可以依赖于各种不同的本技术领域所公知的因素，例 如UV辐照室的物理参数，例如灯和室的尺寸和直径、包含细胞的培养基与UV光源之间 的距离、室的材料的光吸收和反射性质。在本发明的具体实施方案中，细胞以单层、表 面上的一个细胞层的形式被辐照。同理，UV光的波长和强度以及细胞暴露于UV光的接 触时间对于有效剂量来说也是关键的。此外，有效剂量还受细胞自身、含有病毒的培养 基及其光吸收性质的影响。在本发明的各种不同实施方案中，有效剂量足以改变样品中 包含的至少 20%、30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%或 100% 的细胞，在其 他实施方案中，有效剂量足以将细胞改变到其中至少10%的细胞被改变成连续生长的水 平。10%到90%的细胞可以被辐照杀死。在本发明的某些实施方案中，含有细胞的样品 被暴露于至少约 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 或 70mJ/cm2 的 有效剂量。在某些实施方案中，有效剂量高达约500、450、400、350、300、250、200、 180、150、130或105mJ/cm2。在本发明的具体实施方案中，UV剂量在约70到105mJ/ cm2之间。在某些实施方案中，这些剂量被UVC光使用。术语“约”是指通常的UV灯 不提供离散的单一波长UV光(如同激光那样)，而是具有也发射附近波长的光的高斯形 状的光谱的性质。在利用了某些这样的灯的实施方案中，“约”是指波长值偏差10%。在辐照或传代之前或之后，能够对细胞系进行进一步选择，以满足质量控制标 准例如无菌性、不含支原体污染、不含外来病毒污染和/或通过用于检测反转录酶活性 存在的F-Pert测试，以及本技术领域中选择细胞系用于医学生物技术应用时使用的其他 质量控制标准。在这种意义上，“不含”应该被理解为污染被降低到低于当前质量测试 步骤的检测极限。因为本发明的技术不使用病毒载体或导入反转录病毒就能够产生连续 细胞系，因此本发明的细胞系通常不具有任何反转录酶活性，正如可以通过用于反转录 酶活性的测定方法所测试的。但是，出于例如在细胞系中生产病毒或蛋白质的目的，可 以通过分子工程技术将这种反转录病毒活性特异性地引入本发明的细胞系。细胞系可以是任何真核细胞的，特别是较高等生物体的，例如鱼类、禽类、爬 行类、两栖类或哺乳类细胞以及甚至昆虫和植物细胞的细胞系。某些实施方案利用了哺 乳动物细胞例如仓鼠、小鼠、大鼠、狗、马、牛、灵长类或人类；其他实施方案利用了 禽类细胞例如鸡、鸭、金丝雀、鹦鹉、鹌鹑、驼鸟、鸸鹋、火鸡或鹅的细胞。一般来 说，任何鸟类物种可以作为本发明中使用的禽类细胞的来源。在某些实施方案中，利用 驯养得较少的物种(例如鹌鹑或鸸鹋)以避免原种组织被更常见驯养物种(例如鸡)中流 行的病毒的潜在污染，是有利的。被辐照细胞可以来自任何类型的组织。在某些实施方案中，组织源自于胚胎。 在许多实施方案中，使用一种以上类型组织的混合培养物，正如可以通过分解组织或多 个组织所获得的。在其他实施方案中，细胞来自胚胎的脐带。被辐照细胞可以来自、或 组织可以来自或包括例如内皮细胞、上皮细胞、多能或全能干细胞、胚胎干细胞、神经 元细胞、肾细胞、肝细胞、肌肉细胞、结肠细胞、白细胞、肺细胞、卵巢细胞、皮肤细 胞、脾细胞、胃细胞、甲状腺细胞、血管细胞、胰腺细胞和/或它们的前体细胞及其组
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在许多实施方案中，细胞在辐照过程或培养过程中附着于表面。在表面上培养 特别适合于内皮细胞，细胞可以由此进一步选择以满足其他质量标准，例如它们形成单 层的能力，如果UV剂量引入了过多损伤性改变的话，这种能力可能受到妨碍。在这种 表面上，细胞可以形成单层。具体来说，细胞在微载体上培养或辐照。或者，细胞可以 在悬液中辐照或培养或进行两者。最初在表面上辐照或培养的细胞，后来可以适用于在 悬浮培养中生长。另一方面，本发明提供了一种生产病毒的方法，所述方法包括提供可通过本发 明的方法获得的连续细胞系的细胞，用所述病毒感染所述细胞，在所述细胞中增殖所述 病毒，以及收集所述病毒。在本发明中，将要生产的病毒选自具有正义或反义的，连续的或分段的单链或 双链(DNA)基因组的有包膜或无包膜的DNA或RNA病毒。病毒可以选自杆状病毒、 痘病毒、腺病毒、乳多空病毒、细小病毒、嗜肝DNA病毒、冠状病毒、黄病毒、披膜病 毒、星状病毒、小核糖核酸病毒、反转录病毒、正粘病毒、线状病毒、副粘病毒、弹状 病毒、沙粒病毒和布尼亚病毒。在本发明的某些实施方案中，病毒选自有包膜病毒，包 括黄病毒、披膜病毒、反转录病毒、冠状病毒、线状病毒、弹状病毒、布尼亚病毒、正 粘病毒、副粘病毒、沙粒病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒和痘病毒。在其他实施方案 中，病毒是有包膜病毒例如流感病毒包括流感病毒A、B或C、西尼罗病毒、痘苗病毒、 修饰的痘苗病毒或罗斯河病毒。在本发明的其他实施方案中，病毒选自有包膜的RNA病 毒，包括黄病毒、披膜病毒、反转录病毒、冠状病毒、线状病毒、弹状病毒、布尼亚病 毒、正粘病毒、副粘病毒和沙粒病毒。在具体实施方案中，病毒是MVA(修饰的痘苗病 毒安卡拉)、TBE(蜱媒的脑炎)病毒、黄热病病毒、西尼罗病毒、新加勒多尼亚病毒或 流感病毒。在收集步骤后，可以通过任何已知的用于病毒灭活的手段使病毒灭活，例如在 美国专利
发明者曼弗雷德·赖特尔, 沃尔夫冈·蒙特, 西蒙·冯菲尔克斯, 西蒙·费格尔 申请人:巴克斯特医疗保健股份有限公司, 巴克斯特国际公司