专利名称：：对2型猪环状构象病毒(pcv2)感染高度容许的均质细胞系的产生的制作方法对2型猪环状构象病毒(PCV2)感.染高度容许的均质细胞系的产生
背景技术：
：本发明涉及产生2型猪环状构象病毒(PCV2)。更具体地，本发明涉及对PCV2感染高度易感的连续细胞系以及利用所述细胞系产生PCV2的方法。猪环状构象病毒(PCV)是小的无包膜环状单链DNA病毒，其属于环状构象病毒科。Murphy,FA.，Fauquet,CM.，Bishop,DHL.,Ghabrial，SA"Jarvis，AW.,Martelli,GP.;Mayo,MA.，Summers,MD.Virustaxonomy.SixthreportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses.NewYork,N.Y:Springer-Verlag;1995.pp.166-168。其最开始被鉴定并描述为猪肾细胞系的污染物。Tischer,L，Gelderblom,H.,Vettermann，W"Koch，M.A.Averysmallporcineviruswithcircularsingle-strandedDNA.Nature.1982:295:64-66。最近，PCV与猪的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)相联系，该疾病首先在以下文献中涉及WesternCanada.Ellis,丄，Hassard，L.，Clark，E.,Harding,J.，Allan,G"Willson，P.,Strokappe,J.,Martin,K.，McNeilly，F.,Meehan,F.,Todd,D.,Haines,D.Isolationofcircovirusfromlesionsofpigswithpostweaningmultisystemicwastingsyndrome.Can.Vet.J.，1998;39:44-51;Harding,J.C.S.:Clark,E.G.Recognizinganddiagnosingpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS).SwineHealthProd.1997;5:201—203;JueLiu，IsabelleChen,andJimmyKwang,J.Virol2005:7P(13);8262-74。PWMS作为一种主要的疾病出现，其对全球的猪工业经济造成极大威胁。其首次出现于加拿大之后，PMWS目前已经播散到美国、欧洲和亚洲。该综合征主要影响6-14周的幼仔。在患病猪中呈缓慢渐进性进展，死亡率高。见http:〃www.aphis.usda.ciov/vs/ceah/cei/taf/emerqin。cliseasenoticefiles/pmws0301htm。PMWS高度可变。患病猪显示慢性消耗，呼吸窘迫，腹泻，动作失调，麻痹，皮肤苍白以及蓝耳的表现。猪通常会显示生长速度减慢，以及有时会出现黄疸。PMWS的诊断基于患病猪的年龄，典型的消耗表现以及尸检病变。显微镜和免疫组织化学组织检测显示独特的肺和淋巴样组织病变，其中存在PCV2。Id.抗细菌药物通常对于PWMS无效并且目前没有可用的疫苗。症状的预防基于生物安全防护和良好的畜牧习惯。PCV2已经被发现与其他疾病相关，包括猪皮炎肾病综合征("PDNS"),先天性震颤(CT-AIl)，繁殖疾病，产前心肌炎(prenatalmyocarditis)和增生性坏死性肺炎。利用PCV抗原的疫苗已经显示了在预防PMWS中的初步成功。Fenaux，M.,etal.，Achimericporcinecircovirus(PCV)withtheimmunogeniccapsidgeneofthepathogenicPCVtype2(PCV2)clonedintothegenomicbackboneofthenonpathogenicPCVIinducesprotectiveimmunityagainstPCV2infectioninpigs.丄Virol，2004.75(12):p.6297-303;Blanchard，P.etal"Protectioncontrelamaladied'amaigrissementduporcelet(MAP)parvaccinsaADNetproteinesrecombinantes.JourneesdelaRecherchePorcineenFrance,2004.36:p.345-352;Blanchard,P.，etal"Protectionofswineagainstporcinemultisystemicwastingsyndrome(PMWS)byporcinecircovirustype2(PCV2)proteins.Vaccine,2003.21:p.4565-4575;Pogranichniy,R.etal.EfficacyofinactivatedPCV2vaccinesforpreventingPMWSinCDCDpigs,AmericanAssociationofSwineVeterinarians.2004.DesMoines，Iowa。但是，目前没有可用的有效疫苗。PMWS以及其他PCV2病毒感染相关疾病的疫苗、诊断剂和治疗的开发需要有效且可靠的大量制造所述病毒的手段。PCV2病毒母液常规地通过在猪肾细胞系PK15上培养所述病毒来产生。从PK15细胞培养物产生的病毒效价表达为50。/。组织培养感染剂量("TCID50")每毫升，通常为104-105并且不超过105。感染的PK15细胞培养物的免疫荧光染色显示仅仅大约40%的细胞群对PCV2感染易感。需要对PCV2感染高度容许并可靠地在延长的时间中以高效价产生病毒的连续细胞系。4附图简述图1显示免疫荧光测定的结果，显示感染后3天被PCV2感染的非克隆的和克隆的PK15细胞单层的感染百分比。A,B，C和D分别代表模拟感染的PK15单层(阴性对照)，感染的PK15单层，低容许和高容许(克隆C1)亚克隆的单层。图2显示37°C吸附1小时后，PCV2附着于PK15细胞系低和高容许细胞克隆的表面膜。图3显示PK15和克隆Cl细胞群在48小时中的生长曲线。图4显示在亲代PK15和克隆的Cl细胞系在4代中产生的PCV2病毒。图5显示亲代PK15和克隆的Cl细胞系中PCV2病毒基因组合成。发明简述本发明提供了对PCV2感染高度容许的连续细胞系。另一实施方案中，本发明提供了产生对PCV2感染高度容许的基本均质的细胞系的方法，其包括(l)培养含有对PCV2感染具有不同易感性的细胞的均质细胞群；(2)稀释所述细胞培养物并将稀释的细胞的等份试样置于分离的容器内使得每个容器含有大约一个细胞;(3)将PCV2加入每个容器；(4)培养所述细胞并鉴定含有对PCV2感染易感的细胞的容器；和(5)培养并维持来自这种细胞的细胞系。具体实施方案中，本发明提供了名为PK15-C1的连续细胞系。其他实施方案中，本发明提供了产生PCV2的方法，所述方法通过在本发明的细胞系中在适合细胞生长的条件下培养病毒并回收所述细胞系产生的病毒来进行。
发明内容本发明发现了PK15猪肾细胞系中的细胞群体对于PCV2感染的容许性而言是异质的。发现所述的细胞系含有对病毒感染具有低和高容许性的细胞。PCV2-感染的PK15产生的相对低病毒效价是由于细胞系的异质性。本发明的均质细胞系可通过克隆单个细胞并鉴定对PCV2感染高度易感的所得培养物来产生。虽然PK15细胞系是用于本发明方法中的优选细胞系，其他对PCV2感染易感的细胞系也可用于产生产生均质病毒的细胞系。，均质细胞群的培养物首先稀释成包含单个细胞的等份试样。所述单细胞等分试样置于独立的容器中，诸如微量滴定板的孔中，并悬浮在含有细胞复制所需营养成分、生长因子和缓冲液的营养培养基中。它们随后在诱导细胞生长的温度和大气条件下保温。细胞生长之后，例如生长到连续单层之后，将感染量的病毒加入每个等分试样并培养细胞直到达到适宜的病毒产生阶段。测定每个等分试样的病毒效价，例如通过免疫荧光测试，所述的测定根据以下方案感染后(pi)72小时感染的细胞用4%多聚甲醛固定15分钟，与PCV2ORF-l抗体以及随后与抗豚鼠异硫氰酸荧光素(FITC)保温，每次在37'C保温1小时，每个步骤之间用磷酸缓冲盐水洗涤细胞一次。染色结果在奥林巴斯荧光显微镜下观察并对细胞产生高病毒效价的能力进行评分。高病毒产生细胞系随后有利地再克隆并选出高度容许细胞。本发明产生的优选的细胞系来自细胞系PK15(ATCCCCL-33)并称为克隆C1。在本发明中优选称为PK15-C1。本发明的结果显示克隆的C1细胞群比PK15细胞对PCV2感染更易感。因此，PK15-C1与亲本PK15细胞系相比是更有效产生高PCV2病毒产量的细胞系。PK15-C1己经在美国典型培养物保藏中心保藏，保藏号PTA-8244。本发明还通过以下实施例说明，其目的并非限制本发明。实施例1产生PK15-C1PK15亲本细胞系维持在Eagle's极限必需培养基(MEM)中，所述培养基中补充有5。/。胎牛血清(FBS),2.2g/L碳酸氢钠，2mML-谷氨酸，1.0mM〗丙酮酸钠和抗生素。PK15细胞的克隆通过有限稀释法进行。细胞用胰蛋白酶消化，以平均浓度1细胞/孔在MEM/20%FBS/60%调节的培养基中稀释，并分配在96孔组织培养板中。立即筛选所述的板的单个细胞并进行标记，在37°(^和5%C02大气下保温该板。鉴定来自最初的孔的细胞单层之后，对这些亚克隆进行另一轮进一步的克隆。PK15亲本和克隆的细胞群通过免疫荧光测定(IFA)筛选高和低容许细胞。所述细胞在96孔板中接种到70%汇合并在接种后6小时用PCV2感染，效价为大约105TCID50/ml。将葡糖胺(300mM)加入感染24小时内的感染细胞中，所述细胞维持在MEM/5%FBS中、37。C/5。/。C02下。该实验中所用阳性和阴性对照分别为105TCID5。/ml的PCV2病毒上清(s/n)和MEM/5%FBS。所述细胞用4%多聚甲醛固定，IFA在感染后(pi)72小时进行。IFA结果显示与PK15亲代细胞中的40%PCV2感染以及保持低容许性的细胞克隆中的低于20%感染相比，在高容许克隆Cl细胞中出现最高的90%PCV2感染(图1)。此外，进行病毒附着测定来观察PCV2与每个细胞克隆的细胞表面膜的亲和力。每个细胞克隆接种于细胞培养玻片上并如上所述保温过夜以获得70%汇合。将107TCID50/ml的PCV2加入细胞在37。C吸附1小时并用4%多聚甲酸固定。IFA如上所述继续进行，但是利用PCV2ORF-2抗体作为一级抗体。最后的洗涤之后，染色的细胞用荧光包埋介质包埋并在ZeissMeta倒置共聚焦显微镜下观察。共聚焦显微镜下的结果显示在37°C吸附1小时之后PCV2附着于克隆的和非克隆的PK15细胞的细胞表面膜，如图2所示。A，B,C和D分别代表摸拟感染的PK15单层(阴性对照)，感染的低容许、高容许(克隆Cl)亚克隆单层以及感染的PK15单层。1)FITC荧光染色图像。2)光相(lightphase)和绿色荧光图像的重合。荧光的扩散和强度，表示PCV2附着于细胞表面膜，在高容许性细胞克隆C1上最强，然后是未克隆的PK15细胞和低容许细胞克隆。这些结果提示克隆C.l对PCV2感染最易感，由此被选择用于PCV2病毒的增殖。实施例2PK15-C1的表征PK15亲代细胞和克隆Cl细胞通过它们以小时为单位的平均代长表征。大约lxl()S个细胞接种到6孔板，在MEM/10%FBS中培养。细胞经胰蛋白酶消化，计数，经DNA提取并在接种后0,4,8，16,24，32和48小时定量。根据细胞计数和DNA定量数据，PK15亲代和克隆Cl细胞群的平均代长分别为12.1和14.6小时。结果显示于图3，表1提示PK15亲代细胞比克隆Cl细胞倍增得更快。然后，在PK15亲代和克隆C1细胞的病毒产物之间比较培养物上清中释放的病毒的效价。所述细胞在150cm^且织培养瓶中接种到70%汇合，并在接种后6小时用PCV2(l(^TCID50/ml)感染。感染的培养物用D-葡糖胺并如前所述维持在培养基中。最后，病毒感染的培养物在感染后4天(DPI)冻干3次，细胞碎片在3500rpm、4°C沉淀5分钟，获得包含PCV2病毒的上清。PCV2病毒在PK15亲代和克隆C1细胞系中连续传代，收获并保存在-80。C直到利用Cl克隆通过IFA测定感染力。IFA结果显示与从亲代PK15细胞系产生的较低效价105TCID5Q/mL相比，Cl细胞克隆在5次连续传代之后产生最大的病毒效价1()8TCID50/mL(图4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>亲代PK15和Cl细胞克隆中PCV2的DNA复制速度也利用实时PCR法评估。感染后4天(DPI)收获200微升的每种PCV2感染的PK15和Cl细胞裂解物，利用QiaAmpDNAMini试剂盒(QIAGEN，Inc.,Valencia,CaliforniaUSA)进行DNA提取。纯年的DNA随后在200微升无菌蒸馏水中洗脱。实时PCR利用RocheLightCyclersystem(RocheAppliedScience,Indianapolis,IndianaUSA)进行。1微升每种DNA提取物用作PCR模板，并使用PCV2特异性引物对进行扩增(正向引物5'cacctggttgtggtaaaagc3',反向引物5'ggtctgattgctggtaatcg3')。含有PCV2基因组插入物的PBluescript质粒(Stratagene，LaJolla，CaliforniaUSA)用作标准参照。实时PCR定量显示lmLPK15和Cl细胞裂解物中PCV2的基因组DNA拷贝数分别为107和IO，图5)。尽管本发明通过举例说明，应理解本领域技术人员可进行变化而不偏离本发明的精神和权利要求限定的范围。权利要求1.连续产生2型猪环状构象病毒(“PCV2”)的方法，包括用所述病毒感染猪肾细胞系PK15-C1，在适合细胞生长的条件下培养所述细胞系；以及回收所述细胞系产生的所述病毒。2.产生基本均质的对2型猪环状构象病毒("PCV2")感染高度容许的细胞系的方法，包括(l)培养含有对PCV2感染具有不同易感性的细胞的均质细胞群;(2)稀释所述细胞培养物并将稀释的细胞的等份试样置于分离的容器内使得每个容器含有大约一个细胞；(3)将PCV2加入每个容器;(4)培养所述细胞并鉴定含有对PCV2感染易感的细胞的容器；和(5)培养并维持来自这种细胞的细胞系。3.权利要求2的方法，其中所述均质细胞群是PK15细胞群。4.权利要求2的方法，其中步骤2-5重复至少一次。5.连续产生2型猪环状构象病毒("PCV2")的方法，包括用PCV2感染权利要求2，3或4的方法产生的细胞系，在适合细胞生长的条件下培养所述细胞系，以及回收所述细胞系产生的所述病毒。6.权利要求2，3或4的方法产生的连续产生2型猪环状构象病毒("PCV2")的细胞系。7.细胞系PK15-C1，其于2007年3月20日以PTA-8244保藏在美国典型培养物保藏中心。全文摘要本发明涉及对2型猪环状构象病毒(“PCV2”)感染高度容许的连续细胞系。PCV2是猪的断奶仔猪多系统衰竭综合征(“PMWS”)的致病因子。PMWS作为主要的疾病出现，对全球的养猪工业经济产生极大威胁。本发明的高容许细胞系提供重组且可靠的PCV2来源以用于开发PMWS的疫苗，治疗和诊断剂。文档编号C12R1/93GK101688185SQ200780053724公开日2010年3月31日申请日期2007年5月11日优先权日2007年5月11日发明者A·L·H·凌,H-S·康,J·L·S·基申请人:淡马锡生命科学研究院有限公司