猪圆环病毒2型诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪圆环病毒2型诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法，该法通过口服、滴鼻、腹腔注射三种途径联合感染昆明系小鼠PCV2，建立了小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型，用于细胞氧化应激相关指标的测定。该模型具有构建方便、成本较低、实用性强等特点，它为研究PCV2感染体内免疫细胞在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制提供了较理想的体外模型，进而将有可能为PCV2感染引起的动物疾病的治疗提供一些新思路。
【专利说明】
猪圆环病毒2型诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法
技术领域
[0001]本发明属于免疫细胞氧化胁迫模型技术领域，尤其涉及一种猪圆环病毒2型诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法。
【背景技术】
[0002]断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)对全世界养猪业造成了严重损失，尽管临床上PMffS多是由多种病原混合感染和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)感染后继发其他病原感染造成，但PCV2仍是主要病原，其主要感染哺乳仔猪和育肥猪。PCV2病毒单独感染后病猪往往表现为亚临床型，而当PCV2与其他病原混合感染，或者因感染PCV2造成免疫低下引发继发感染时，病猪表现出的临床症状呈多样性且不具典型性。多种病毒感染均能引起动物机体免疫抑制，PCV2为其中的一员，其感染可使其他病原更易感，或造成疫苗效果不佳甚至免疫失败，降低了疫苗免疫的保护率。因此，对PCV2感染引起的相关疾病的研究在生产中具有重要意义，然而，关于PCV2感染体内免疫细胞在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制还缺乏认识，亟待进一步研究。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种构建方便、成本较低、实用性强的猪圆环病毒2型诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法，为研究PCV2感染体内免疫细胞在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制提供较理想的体外模型。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:
[0005]猪圆环病毒2型诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法，采用猪圆环病毒2型通过口服、滴鼻、腹腔注射三种途径联合感染小鼠，猪圆环病毒2型病毒滴度为104TCID5o/0.1mL。
[0006]感染剂量为PCV2原液ImL，感染时间为第1、2、3天。
[0007]上述猪圆环病毒2型诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法，包括以下步骤:
[0008](I )PCV2实验性感染小鼠方案的选择
[0009]选取SPF级体重20 土 2g昆明系小鼠108只，随机分为6组，每组18只，雌雄各半，饲养温度恒定在22 ± 2°C ;暂养5天使其充分适应环境，以减少应激，并让其自由采食及饮水，小鼠于实验开始前12h禁食，提前6h禁水；
[0010]其中，Al组、BI组、空白对照I组:第1、2、3d感染PCV2、10—1PO^生理盐水，ImL/只/d; A2组、B2组、空白对照2组:第1、3、5、7d感染PCV2、I O—1PO^、生理盐水，ImL/只/d;
[0011]接种病毒后并分别于接种后第7d、14d、21d每组分别剖杀小鼠6只，PCR检测小鼠脾脏、肺脏中PCV2抗原，确定PCV2感染方案；
[0012](2) PCV2感染昆明系小鼠氧化胁迫模型的建立
[0013]将72只昆明系小鼠随机分为6组，雌雄各半，每组12只，根据步骤(I)确定的方案感染PCV2，生理盐水作对照组；
[0014]其中，A组、B组、以且:感染PCV2，ImL/只/d，分别在第7d、14d、21d处理小鼠；D组、E组、F组:给予生理盐水，ImL/只/d，分别在第7d、14d、21d处理小鼠；
[0015]分离脾脏细胞，用于进行氧化应激相关指标的测定。
[0016]氧化应激相关指标包括脾脏细胞活性氧水平、脾脏T-GSH、GSH、GSSG含量及X0D、MPO、iNOS 活性。
[0017]小鼠与猪具有较近的亲缘关系，且具有实验周期短，易饲养易操作等优点，且有大量研究表明PCV2能成功感染小鼠。发明人利用其设计并建立了一种猪圆环病毒2型诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法，该法通过口服、滴鼻、腹腔注射三种途径联合感染昆明系小鼠PCV2，建立了小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型，用于细胞氧化应激相关指标的测定。本发明系首次使用猪圆环病毒2型(PCV2)作为诱因建立小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型，并首次使用三种途径联合感染昆明系小鼠PCV2确保小鼠能更有效地感染PCV2，也是首次使用ROS水平、T-GSH、GSH、GSSG含量等指标作为氧化应激的相关评价指标。该模型具有构建方便、成本较低、实用性强等特点，它为研究PCV2感染体内免疫细胞在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制提供了较理想的体外模型，进而将有可能为PCV2感染引起的动物疾病的治疗提供一些新思路。按照本发明的培养条件和方法，能够帮助初次进行小鼠体内免疫细胞氧化胁迫研究的人员较顺利的建立小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型模型。应用本发明，发明人还确定了 PCV2感染小鼠的最佳感染方案。
【附图说明】
[0018]图1是接种病毒7d后检测PCV2病毒的电泳结果图。
[0019]图2是接种病毒14d后检测PCV2病毒的电泳结果图。
[0020]图3是接种病毒21d后检测PCV2病毒的电泳结果图。
[0021 ]图4是PCV2对小鼠脾淋巴细胞ROS水平的变化图。
[0022]图5是PCV2感染对小鼠脾脏GSH水平的变化图。
[0023]图6是PCV2感染对小鼠脾脏GSSG水平的变化图。
[0024]图7是PCV2感染对小鼠脾脏T-GSH水平的变化图。
[0025]图8是PCV2感染对小鼠脾脏XOD活性的变化图。
[0026]图9是PCV2感染对小鼠脾脏MPO活性的变化图。
[0027]图10是PCV2感染对小鼠脾脏iNOS活性的变化图。
[0028]图5至图10中:时间轴上同一时间点对应的各柱状图从左到右分别为空白对照组，PCV2感染组。
【具体实施方式】
[0029]—、实验方法
[0030](I )PCV2实验性感染小鼠方案的选择
[0031 ] 选取SPF级体重20 土 2g昆明系小鼠108只，随机分为6组，每组18只，雌雄各半，饲养温度恒定在22±2°C。暂养5天使其充分适应环境，以减少应激，并让其自由采食及饮水，小鼠于实验开始前12h禁食，提前6h禁水。
[0032]Al组、BI组、空白对照I组:第1、2、3d接种PCV2、I O—1PO^、生理盐水，ImL/只/d。
[0033]A2组、B2组、空白对照2组:第l、3、5、7d接种PCV2、10—1PO^生理盐水，ImL/只/d。
[0034]接种病毒后并分别于接种后第7d、14d、21d每组分别剖杀小鼠6只，PCR检测小鼠脾脏、肺脏中PCV2抗原，确定小鼠PCV2感染方案(接种病毒时间和病毒浓度)。
[0035 ] (2) PCV2感染昆明系小鼠氧化胁迫模型的建立
[0036]将72只昆明系小鼠随机分为6组，雌雄各半，每组12只，根据步骤(I)确定的感染方案接种PCV2，生理盐水作对照组。
[0037]A组、B组、C组:接种PCV2，ImL/只/d，分别在第7d、14d、21d处理小鼠。
[0038]D组、E组、F组:给予生理盐水，ImL/只/d，分别在第7d、14d、21d处理小鼠。
[0039](3)DCFH_DA荧光探针检测细胞ROS水平
[0040]无菌取小鼠脾脏，分离小鼠淋巴细胞，调整细胞为1*105，铺于20孔板，每孔加入500yL ΙΟμΜ DCFH-DA荧光探针，37°C，5%⑶2孵育60min，每15min轻轻摇匀一次。孵育完毕后弃上清，PBS洗3次，再加入2000yL PBS，将细胞吹下并吹匀，于荧光分光光度计测定荧光值(激发波长488nm，发射波长525nm)。
[0041 ] (4)小鼠脾脏T-GSH、GSH、GSSG含量及X0D、MP0、iN0S活性的检测
[0042]小鼠脾脏按重量(g):体积(ml)= 1:9的比例加入9倍体积的预冷生理盐水，于匀浆管中，冰水浴条件下进行匀浆。4°C，5000rpm，离心1min，取上清液分装，做好标记，用于检测 T-GSH、GSH、GSSG 含量及 X0D、MP0、iN0S 活性。检测时，严格按照 T-GSH、GSH、GSSG、X0D、MP0、iNOS测定试剂盒说明进行操作。
[0043](5)数据分析
[0044]实验数据采用SSP21.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way AN0VA)，结果以平均值土标准差表示。肩标*表示与空白对照组相比存在显著性差异(P <0.05 )，肩标**表示与细胞对照组相比存在极显著差异(P<0.01)。
[0045]二、实验结果
[0046]<a>PCV_2实验感染小鼠模型的感染方案确定(图1、图2、图3)
[0047]实验组1、2、3天接种及1、3、5、7天接种PCV2病毒的小鼠和正常对照组小鼠均未表现出明显的临床症状，且精神状态正常，饮食情况正常。剖杀时其心、肝、脾、肺、肾等均未见明显病理变化。
[0048]如图1显示，在接种PCV27d后，经PCR扩增检测小鼠肺脏、脾脏组织中的PCV2病毒核酸，接种PCV2原液的Al、A2组在1154bp处有强特异性扩增条带;而接种10—1PO^病毒的B1、B2组检测到的特异性片段较弱；空白组未检测到特异性片段。如图2、3显示，在接种PCV214d、21d，接种PCV2原液的Al、A2组在1154bp出有强特异性扩增条带，且Al组所检测出的特异性条带较强、A2组较Al组弱；而接种10—1PO^的B1、B2组检测到的特异性片段较微弱；空白组未检测到特异性片段。
[0049]结果表明，对小鼠采用腹腔注射以及滴鼻和口服三种途径联合且多次接种PCV2能成功感染小鼠，建立PCV2感染小鼠模型，且1、2、3天接种病毒感染效果优于1、3、5、7天接种病毒，PCV2原液感染效果优于10—1PO^病毒。根据实验结果，选择后续实验感染方案为:第1、
2、3天每天经三种途径联合感染10VCV2病毒，ImL/只/d。
[0050]<b>PCV2感染对小鼠脾淋巴细胞ROS产生的影响(图4)
[0051 ] 图4显示，PCV2感染小鼠7d、14d、21d后，小鼠脾淋巴细胞ROS水平随时间稍有降低。与空白对照组相比，PCV2感染小鼠7d、14d、21d均升高细胞内ROS水平，与空白对照组比较存在极显著差异(P<0.01)。结果表明，PCV2感染小鼠能明显升高小鼠体内脾淋巴细胞产生ROS水平，脾淋巴细胞处于氧化胁迫状态。
[0052 ] <c>PCV2感染对小鼠脾脏氧化还原状态的影响(图5、图6、图7)
[0053]图5显示，与空白对照组中正常小鼠相比，PCV-2感染小鼠7d、14d、21d后，不同程度降低小鼠脾脏GSH水平，其中感染后7d、14d小鼠脾脏GSH水平与空白对照组比较存在显著性差异(P<0.05)，感染后21d小鼠脾脏GSH水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
[0054]图6显示，与空白对照组中正常小鼠相比，PCV-2感染小鼠7d、14d、21d后，不同程度升高了小鼠脾脏GSSG水平，其中感染后7d小鼠脾脏GSSG水平明显高于空白对照组，差异具有统计学意义(P< 0.0I)，感染后14d、21 d小鼠脾脏GSSG水平高于空白对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。
[0055]图7显示，与空白对照组中正常小鼠相比，PCV-2感染小鼠7d、14d、21d后，不同程度降低小鼠脾脏T-GSH水平，其中感染后7d小鼠脾脏T-GSH水平显著低于空白对照组，且差异具有统计学意义(P<0.05)，感染后14d小鼠脾脏T-GSH水平与空白对照组比较存在极显著差异(P<0.01)，感染后21d小鼠脾脏T-GSH水平低于空白对照组，但差异无统计学意义(P〉0.05)。实验结果表明，PCV-2感染小鼠能明显升高小鼠脾脏GSSG水平，降低小鼠脾脏GSH水平，使小鼠脾脏T-GSH总体水平降低，从而改变PCV-2感染的小鼠脾脏氧化还原状态。
[0056]<d>PCV2感染对小鼠脾脏X0D、MP0、iNOS活性的影响(图8、图9、图10)
[0057]图8显示，与空白对照组中正常小鼠相比，PCV2感染小鼠7d、14d、2Id后，不同程度升高了小鼠脾脏XOD活性，其中感染后7d脾脏XOD活性与空白对照组比较存在显著性差异(P<0.05)，感染后14d、21d小鼠脾脏XOD活性与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
[0058]图9显示，与空白对照组中正常小鼠相比，PCV2感染小鼠7d、14d、2Id后，不同程度升高了小鼠脾脏MPO活性，其中感染后7d小鼠脾脏MPO活性与空白对照组比较存在显著性差异(P<0.05)，感染后14d、21d小鼠脾脏MPO活性与空白对照组比较差异无统计学意义(P>
0.05)。
[0059]图10显示，与空白对照组中正常小鼠相比，PCV2感染小鼠7d、14d、21d后，不同程度升高了小鼠脾脏iNOS活性，其中感染后7d小鼠脾脏iNOS活性与空白对照组比较差异显著(P<0.05)，感染后14d、21d小鼠脾脏iNOS活性与空白对照组比较差异无统计学意义(P>
0.05)。实验结果表明，PCV2感染小鼠能明显升高小鼠脾脏XOD、MP0、iNOS活性，从而催化改变PCV2感染的小鼠脾脏氧化还原状态。
[0060]三、研究结论
[0061]本实验采用腹腔注射、滴鼻、经口三种途径联合以及多次感染方式，在感染后第7d、14d、21d时，分别采用PCR方法特异性扩增PCV2病毒核酸，结果显示，无论是PCV2原液感染昆明系小鼠，其肺脏、脾脏组织的DNA经PCR扩增后，电泳结果均检测到特异性条带。此外，PCV2病毒原液感染组检测出的特异性条带较10—1PO^感染组强，第1、2、3d连续感染组小鼠测到PCV-2病毒核酸的特异性条带强于l、3、5、7d感染组。故后续实验的感染方案确定为用PCV-2原液，采用腹腔注射、滴鼻、经口三种途径联合以及1、2、3天连续多次感染的方式进行PCV2接种。而PCV2感染小鼠7d时明显升高小鼠脾脏XOD、MPO、iNOS活性，而感染后14d、21d时XOD, MPO、iNOS活性逐渐趋向于正常小鼠酶活性水平，表明PCV2感染7d后显著改变小鼠XOD、MPO、iNOS酶活性，从而催化产生各种过氧化物，对小鼠脾淋巴细胞造成氧化胁迫。
[0062]本实验结果表明，PCV2成功感染小鼠，病毒接种(病毒感染)方式为口服、滴鼻、腹腔注射三种途径联合感染;PCV2感染方案:感染病毒时间为第1、2、3天，感染病毒浓度为滴度为104TCID5Q/0.1mL的PCV2原液，最终感染时间为7天(即在首次感染PCV2第7天处理小鼠)。通过升高感染小鼠脾淋巴细胞ROS水平、上调细胞XOD、MP0、iNOS活性，降低GSH和T-GSH水平，以改变感染小鼠脾脏氧化还原状态，成功建立免疫细胞氧化胁迫动物模型。
【主权项】
1.一种猪圆环病毒2型诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法，其特征在于:采用猪圆环病毒2型通过口服、滴鼻、腹腔注射三种途径联合感染小鼠，猪圆环病毒2型病毒滴度为 104TCID5o/0.1mL。2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法，其特征在于:所述感染剂量为PCV2原液ImL，感染时间为第1、2、3天。3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法，其特征在于:包括以下步骤: (I )PCV2实验性感染小鼠方案的选择 选取SPF级体重20 ± 2g昆明系小鼠108只，随机分为6组，每组18只，雌雄各半，饲养温度恒定在22±2°C;暂养5天使其充分适应环境，以减少应激，并让其自由采食及饮水，小鼠于实验开始前12h禁食，提前6h禁水； 其中，Al组、BI组、空白对照I组:第1、2、3d感染PCV2、I O—1PO^、生理盐水，ImL/只/d; A2组、B2组、空白对照2组:第l、3、5、7d感染PCV2、10—1PO^生理盐水，ImL/只/d; 接种病毒后并分别于接种后第7d、14d、21d每组分别剖杀小鼠6只，PCR检测小鼠脾脏、肺脏中PCV2抗原，确定PCV2感染方案； (2)PCV2感染昆明系小鼠氧化胁迫模型的建立 将72只昆明系小鼠随机分为6组，雌雄各半，每组12只，根据步骤(I)确定的方案感染PCV2，生理盐水作对照组； 其中，A组、B组、C组:感染PCV2，lmL/只/d，分别在第7d、14d、21d处理小鼠；D组、E组、F组:给予生理盐水，ImL/只/d，分别在第7d、14d、21d处理小鼠； 分离脾脏细胞，用于进行氧化应激相关指标的测定。4.根据权利要求4所述的猪圆环病毒2型诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法，其特征在于:所述氧化应激相关指标包括脾脏细胞活性氧水平、脾脏T-GSH、GSH、GSSG含量及XOD、MP0、iNOS活性。
【文档编号】A61K35/76GK105853468SQ201610254793
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】胡庭俊, 尹丹, 谭红连, 韦英益, 郝祝兵, 杨剑
【申请人】广西大学