一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重pcr的引物组及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、 猪细小病毒三重PCR的引物组及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒 II 型（Porcine circovirus II，PCV2)、猪细小病毒（porcine parvovirus, PPV)、猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus, PRV)是我国集约化养 猪场普遍流行的重要病原，给养猪业造成了严重的经济损失。由于这三种病毒常呈混合感 染，增加了分析判断群体感染和发病的难度。目前，常规的分析方法如病毒分离、血清学方 法等存在着耗时长、敏感度低的缺陷，已不能满足现实生产及防病需要。
[0003] 目前，由猪圆环病毒II型、猪细小病毒以及猪伪狂犬病病毒感染引起猪免疫抑制 及繁殖障碍等病症已经成为影响我国乃至全球养猪业的一种疾病，造成巨大经济损失。我 国是养猪大国，研究针对三种病原混合感染的快速准确的分析方法对于养猪业健康发展具 有重要意义。传统的病毒分离鉴定等方法耗时耗力，对于实验条件要求比较苛刻，在一般实 验室及基层单位较难进行，同时受采样条件所限，分离率往往也较低，并且传统的血清型诊 断方法有操作繁琐复杂，耗时耗力，特异性和灵敏性低等多种不足。随着分子生物学的发 展，PCR检测方法能够快速、高效的检测出病原体。。
[0004] 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR)具有快速、敏感、特异等优点， 自发明以来在病原的特异性检测方面表现出明显的优势，多重PCR方法不仅保持了普通 PCR敏感性高和特异性强的优点，且具有一次检测多种病原的优势，更适于混合感染的快速 诊断。本发明针对三种病毒的保守基因设计了特异性引物，拟构建能够同时检测猪三种常 见病毒感染的多重PCR方法并初步应用于临床样品的检测。
[0005] 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体 系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的 PCR技术。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。所以建立检测猪圆 环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒的三重PCR方法对于猪关节病的防治具有重要意义， 可以为其防治提供有力的技术手段。
【发明内容】
[0006] 鉴于三种病毒是当前集约化猪场的常见重要病原体，且往往与多种病毒和细菌混 合感染，引起猪免疫抑制及繁殖障碍等疾病，传统的分析鉴定技术费时费力，不适于临床快 速检验分析，也不适于大规模的流行病学调查的现状，本发明目的在于克服现有技术的不 足，提供一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组及其应 用。
[0007] 本发明针对实际生产中猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒混合感染，且 临床很难区分的情况，本着从样品中同时分析鉴定三种病原体的目标，从已发表的文献中 筛选出具有病原体致病性特点的保护性片段的编码基因片段，作为PCR检测的三个基因靶 点，得到同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组。同时本发 明将扩增这3个基因片段的引物组放在一个PCR反应体系，通过对退火温度、特异性等各项 参数调整优化，建立了可直接从样品中鉴定分析三种病原体的三重PCR方法。
[0008] 猪圆环病毒2型（PCV2)的0RF2编码病毒的Cap蛋白，血清学实验显示，对于无致 病性的PCVl与致病性的PCV2,两者的R印蛋白会产生抗原交叉性，而Cap蛋白不产生交叉 反应，因此选择0RF2编码的结构蛋白作为检测目的片段；猪伪狂犬病毒（PRV)的gB(g II ) 是PRV所有糖蛋白中最保守的，是病毒的一个重要包膜组分和中和抗原，是病毒感染宿主 细胞必不可少的成份；而猪细小病毒（PPV)的VP2蛋白是构成PPV病毒粒子的主要保护性 抗原，具有血凝活性和良好的免疫原性，可以诱导机体产生强烈的免疫反应。因此，与传统 PCR不同，本发明选择上述三个基因片段作为三重PCR的靶标分子，这样一方面可及时验证 目标病原体在样品中的存在，更重要的是可对所扩增的病毒保护性片段进行序列分析，实 时监测病原主要保护性蛋白的变异，为及时掌握病毒致病性特点及其变异趋势和规律、选 择合适的疫苗提供科学依据。
[0009] 本发明是通过以下的技术方案实现的。
[0010] 本发明提供一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引 物组，扩增猪圆环病毒2型的上游引物序列如SEQ ID NO: 1所示，扩增猪圆环病毒2型的下 游引物序列如SEQ ID N0:2所示；扩增伪狂犬病毒的上游引物序列如SEQ ID N0:3所示，扩 增伪狂犬病毒的上游引物序列如SEQ ID N0:4所示；扩增猪细小病毒的上游引物如SEQ ID NO:5所示，扩增猪细小病毒的上游引物序列如SEQ ID NO:6所示。（见表1)
[0011] 表1多重PCR引物组
[0014] 本发明进一步提供上述三重PCR的引物组在制备同时检测猪圆环病毒2型、伪狂 犬病毒、猪细小病毒试剂中的应用。
[0015] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明筛选具有猪圆环病毒2型 (PCV2)特点的0RF2编码基因、猪伪狂犬病毒（PRV)的gB(g II )编码基因以及猪细小病毒 (PPV)的VP2蛋白的编码基因，作为PCR检测的三个基因靶点，得到检测猪圆环病毒2型、伪 狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组；同时本发明在退火温度及其他反应体系参数等 方面进行探索，确定灵敏度高、特异性强的多重PCR检测体系，建立直接从样品中检测三种 病原体的三重PCR检测方法，实验证明，较现有报道的PCR检测方法，利用本发明的引物组 的多重PCR检测方法特异性强、灵敏度高，检测效率高。
[0016] 与传统PCR逐一扩增单一病原体不同，本发明针对病原体三个基因靶点，这样一 方面可及时验证目标病原体在样品中的存在，更重要的是可对所扩增的病毒保护性片段进 行序列分析，实时监测病原主要保护性蛋白的变异，为及时掌握病毒致病性特点及其变异 趋势和规律、选择合适的疫苗提供科学依据。
【附图说明】
[0017] 图1为多重PCR退火温度的确定图示；(M :DNA2000Marker ;1为阴性对照；2~6 退火温度分别为 52 °C、54°C、56 °C、58 °C、60 °C )。
[0018] 图2为多重PCR特异性测定结果图示；(M :DNA2000Marker ;1~9模板分别为PPV、 PCV2、PRV、PPV+PCV2+PRV、PRRSV、Ε· coli、PDEV、TGEV、（IdH2O)。
[0019] 图3为多重PCR敏感性测定结果图示；(M :DNA2000Marker ;1为阴性对照；2~ 9. 10°~10 7倍比稀释的质粒多重PCR结果）。
【具体实施方式】
[0020] 本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过 程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件。
[0021] 实施例1扩增猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒保护性片段三重PCR 体系退火温度的确定
[0022] 对于PCR反应体系，特别是多重PCR反应体系中，退火温度是一个关键的因素。本 发明为了摸索三重PCR体系中适合3对引物的退火温度，特设计三重PCR反应体系进行最 佳退火温度确定。
[0023] 1样品前处理
[0024] 取约2g猪扁桃体组织样品于2ml EP管中，并加入1ml Buffer A，利用全自动组 织研磨机进行研磨。取上述研磨液上清250 μ 1至无菌EP管，加10 μ I OB Protease和 250 μ IBuffer BL。再加入4 μ I Linear Acrylamide (每250 μ I Buffer BL)剧烈振荡 15s〇 65°C孵育lOmin，中间短暂震荡1次，加260 μ 1无水酒精，剧烈振荡20s混合均匀，短暂离心 以将盖子上液体全部收集。
[0025] 2病毒DNA的提取
[0026] 将柱子置入新2mlEP管，并用500 μ I Buffer HB洗脱，8000g，lmin，弃去液体，保 留离心管。将柱子放回2mlEP管，并用700 μ I DNA wash Buffer (已加8ml酒精稀释）洗 脱，8000g，Imin离心，弃去离心管及液体。柱子置回EP管，13300g，2min离心，使柱子离干。 (此步对于保证下面理想的洗脱非常重要。）将柱子置于1.5ml EP管，并加50~100 μ 1 Elution Buffer (预热至65°C)，室温下静置5min。8000g，Imin离心以将DNA从柱子上 洗脱，保存离心下的液体（含DNA)。将柱子置入第二个I. 5mlEP管，再次加50~100 μ I Elution Buffer，