鸽圆环病毒样颗粒、其制备方法与应用
【专利摘要】本发明涉及一种鸽圆环病毒样颗粒、其制备方法与应用。本发明将鸽圆环病毒ORF C1基因与昆虫细胞表达载体连接，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统获得鸽圆环病毒样颗粒。将所述鸽圆环病毒样颗粒与防腐剂和佐剂混合，即制备得到鸽圆环疫苗。本发明的鸽圆环病毒样颗粒及其疫苗能高效诱导机体产生抗体，填补了国内此类疫苗的空白。本发明的制备方法适于工业化生产，具有成本低、安全性高等优点。
【专利说明】
鸽圆环病毒样颗粒、其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种鸽圆环病毒样颗粒、其制备方法与应用，属于免疫学及基因工程
技术领域。
【背景技术】
[0002] 鸽圆环病毒(PiCV)由Woods等（1993)首次在美国加利福尼亚发现，患病鸽多为2-12月龄青年鸽，主要表现食欲下降、精神萎靡、羽毛凌乱、呕吐腹泻、多尿、嗉囊充满液体等 临床症状。组织学表现为淋巴器官(法氏囊和胸腺)萎缩，骨髓再生不良。从1994年开始，澳 大利亚和许多欧洲国家包括北爱尔兰、英格兰、德国、法兰西、比利时、意大利等陆续报道发 现鸽圆环病毒。Raue等(2005)通过试验发现青年鸽疾病综合症(YTOS)与鸽圆环病毒的感染 密切相关。Duchatel等(2006)对鸽圆环病毒的传播途径进行了研究，发现鸽圆环通过接触 和垂直传播。
[0003] 鹤圆环病毒属于圆环病毒科(Circoviridae)，1995年国际病毒分类委员会(ICTV) 第六次病毒分类报告上新增的一个病毒科。鸽圆环病毒呈球形，二十面体对称，无囊膜，直 径为15-18nm，其基因组为单链环状DNA，大小约为2.0此。基因组编码5个01^，其中01^￥1编 码Rep复制相关蛋白，0RFC1编码Cap外壳蛋白，其余3个0RF编码功能未知的蛋白质。到目前 为止，圆环病毒科除PCV可以在PK-15等细胞中繁殖以外，其余圆环病毒均尚未能培养成功， 因此圆环病毒特别是禽类的圆环病毒研究受到了一定的限制。
[0004] 鸽圆环病毒在我国广泛流行，并对鸽子的养殖业造成巨大损失。余旭平等（2007) 从中国浙江地区的病鸽体内检测到鸽圆环病毒的广泛存在。余旭平等(2009)设计引物对鸽 圆环病毒浙江株进行了全基因组的克隆并进行了序列分析，发现10个欧美株组成一个大的 分支，而浙江株与澳洲株各自独立分支。
[0005] 鸽圆环病毒无法在细胞系培养，因此尚无鸽圆环疫苗研究的报道，亟待探索鸽圆 环疫苗的制备方法，应对日趋严峻的鸽圆环疫情，提高鸽业养殖效益。
[0006] 近年来，病毒样颗粒作为疫苗抗原逐渐受到重视，特别是适用于无细胞系培养的 病毒。病毒样颗粒是由病毒的结构蛋白自主包装形成，与天然病毒的形态一致，且能够诱导 机体产生细胞免疫和体液免疫。病毒样颗粒不包裹核酸，不能复制，因此也没有感染性，是 一种安全的抗原。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种鸽圆环病毒样颗粒、其制备方法与应用，该 方法利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备鸽圆环病毒样颗粒。
[0008] 本发明的另一目的是提供鸽圆环病毒样颗粒及其应用。
[0009] 本发明的技术方案如下：
[0010] -种鸽圆环病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
[0011] (1)将核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示的鸽圆环病毒ORF C1基因插入到昆虫细胞 表达载体中，转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，提取阳性质 粒，制得整合了鸽圆环病毒ORF C1基因的重组杆状病毒Bacmid质粒；
[0012] (2)将步骤（1)制得的重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得整合了鸽 圆环病毒ORF C1基因的重组杆状病毒；
[0013] ⑶将步骤⑵制得的整合了鸽圆环病毒〇RF C1基因的重组杆状病毒接种昆虫细 胞，培养后收获，经纯化制得鸽圆环病毒样颗粒。
[0014] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中，昆虫细胞表达载体选自：AcRP23_lacZ、 AcRP6_SC、AcUWl_lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII、p89B310、 pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAc(^4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、 pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、 pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、 pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、 pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSH0NEX 1.1、 pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、 pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC_5、pFastBacDual、pFastBacl、pFastBacHT A、pFastBacHT B、pFastBacHT C、pFastBacDual之一或两种以上的混合;进一步优选的，所述步骤（1)中，昆 虫细胞表达载体为pFastBacl。
[0015] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中，重组杆状病毒为重组苜蓿银纹夜蛾核型多角 体病毒rAcMNPV。
[0016]根据本发明优选的，所述步骤（2)中，昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Sf21细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Sf9细胞系、 昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Mimic Sf9细胞系、甜菜夜蛾 (Spodoptera exigua)Se 301 细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLGl细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4 细胞系、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni)BTI-Tn-5Bl-4细胞系、BTI-Tn-5C1 细胞系、Bn-Tn-5F2细胞系，斜纹贪夜蛾(Spodoptera litura)ZSU-Sl-l细胞系、IBL-SL1A细胞系、家蚕卵巢 细胞系BmN之一；进一步优选的，昆虫细胞选自昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Sf21 细胞系。
[0017] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，纯化为采用蔗糖密度梯度离心进行纯化，蔗 糖质量体积浓度为10 %、30 %和50 %，单位g/mL;
[0018] 进一步优选的，所述步骤(3)中，纯化步骤如下：
[0019] 将培养产物经5000rpm离心20min，收集细胞，然后经25mM NaHC03溶液裂解10min， 再经1 X 104rpm离心10min，取沉淀溶解于PBS溶液，加到梯度鹿糖上层液面上，3.5X 104rpm 离心2h，收集在质量体积浓度为10 %~30 %蔗糖液面之间的白带，去除蔗糖，制得鸽圆环病 毒样颗粒。
[0020] 经检测，鸽圆环病毒样颗粒主要有效成分为Cap蛋白。
[0021] -种鸽圆环病毒样颗粒，包括鸽圆环病毒Cap蛋白；所述的鸽圆环病毒Cap蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0022] 上述鸽圆环病毒样颗粒在制备鸽圆环疫苗中的应用。
[0023] 上述鸽圆环病毒样颗粒在制备预防和/或治疗鸽圆环的药物中的应用。
[0024] -种鸽圆环疫苗，该疫苗是由上述鸽圆环病毒样颗粒为药效成分与其他辅料复配 制得。根据本发明优选的，所述其他辅料为防腐剂和/或佐剂。进一步优选的，所述佐剂为 poly I/C 佐剂。
[0025] 上述制备方法中的操作如无特别说明，均可采用本领域常规操作条件。
[0026]有益效果
[0027]本发明采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞生物反应器中安全、高效地生产鸽圆环 病毒样颗粒，所制备的鸽圆环病毒样颗粒及其疫苗能高效诱导机体产生抗体，填补了国内 此类疫苗的空白。本发明的制备方法适于工业化生产，具有成本低、安全性高等优点。
【附图说明】
[0028]图1为本发明实施例3中重组杆状病毒感染Sf21细胞产生细胞病变的结果照片； [0029] 图中，A:空白Sf21细胞;B:感染重组杆状病毒AcMNPV-ORF C1。
[0030] 图2为本发明实施例4中免疫荧光鉴定重组病毒表达鸽圆环病毒蛋白的结果照片；
[0031] 图中，A:感染野生型杆状病毒;B:感染重组杆状病毒AcMNPV-ORF C1。
[0032]图3为本发明实施例4中Western Blot鉴定鹤圆环病毒样颗粒组成的结果；
[0033] 图中，M:蛋白marker;l-2:AcMNPV-0RF C1感染的Sf21细胞；3:野生型杆状病毒感 染Sf21细胞(对照）。
[0034]图4为本发明实施例4中鸽圆环病毒样颗粒的电镜和免疫电镜鉴定结果照片；
[0035]图中，A:鸽圆环病毒样颗粒的电镜结果;B:鸽圆环病毒样颗粒的免疫电镜结果； (标尺= 2〇〇nm) 〇
[0036]图5为本发明实施例5中脾细胞SFCs和脾细胞产生细胞因子水平的分析结果柱状 图；
[0037]图中，A:小鼠脾细胞上清中产生的IFN- Y浓度;B:小鼠脾细胞上清中产生的IL-2 浓度;C:小鼠脾细胞上清中产生的IL-4浓度。
[0038]图6为本发明实施例5中鸽圆环病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后的抗体水平柱状图。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0040] 若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册 (Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual ,2001)，或按照制造 厂商说明书建议的条件。
[0041] 实施例1重组转移载体的构建
[0042] 1、鸽圆环结构基因的获得
[0043] 鸽圆环病毒0RF C1基因核苷酸序列来源于GenBank(登录号为DQ090945)，核苷酸 序列由上海生工合成，长度为822bp，并将目的序列连接至PUC57载体(购自Thermo Fisher Scientific公司），命名为PUC57-0RF Cl。
[0044]鸽圆环病毒0RF Cl基因的原始核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，由它编码的氨基 酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0045] 2、酶切、连接、转化及鉴定
[0046] 将pFastBacl载体（购自Invitrogen公司）和PUC57-0RF C1质粒进行酶切处理，酶 切体系50yl，组成如下：
[0047] DNA 10yl，限制性内切酶BamHI/限制性内切酶Notl各2yl，10 XM缓冲溶液5yl，dd H20 31yl〇
[0048]混匀后，在37°C条件下酶切5h。然后，纯化后的酶切产物用于DNA连接，连接体系20 yl，组成如下：
[0049] 缓冲液2yl，T4连接酶lyl，酶切目的产物7.5yl，酶切后的载体1.5yl，ddH20 8yl。 混匀后，16°C连接8h。
[0050]最后，将连接产物与感受态细胞(E.coli DH5)采用热休克方法进行转化，获得阳 性质粒pFastBacl-ORF C1。
[00511实施例2重组杆状病毒的构建 [0052] 1、重组杆状病毒基因组的构建
[0053] 将pFastBacl-ORF C1转移载体转化E.coli DHlOBac感受态细胞(含有苜蓿银纹夜 蛾核型多角体杆状病毒AcMNPV基因组，Invitrogen Cat N0.10359-016)，转化条件如下：
[0054]将2yl pFastBacl-ORF C1 与E.coli DHlOBac混匀后，冰浴35min，42°C热应激50s 后，再进行冰浴3min，然后，加入lml无抗性LB培养基，在37 °C、200rpm条件下培养4~5h后， 菌液进行1〇4、1〇4、1(^倍比连续稀释，从各稀释液中分别取l〇〇yl涂在含有三抗抗性LB细 菌培养皿上（含50iig/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、lOμg/ml四环霉素、浓度40iig/mlX-gal)，37°C培养48h后，进行蓝白斑筛选。
[0055] 2、重组杆状病毒基因组的鉴定
[0056]在上述培养皿中，挑取白斑菌落，划线于含有三抗和X-gal的细菌培养皿上，继续 培养48h后，挑取白色菌落，接菌至含三抗抗性的液体LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L， 氯化钠l〇g/L)中，在37 °C、200rpm条件下培养12~16h后，按照Bac-to-Bac35Baculovirus Expression System说明书中的操作方法提取重组杆状病毒基因组DNA。
[0057]实施例3重组杆状病毒的拯救
[0058]将提取的重组杆状病毒基因组DNA转染昆虫细胞Sf21，转染过程如下：
[0059] (1)将4yg重组DNA加入到250yl无血清和双抗的Grace培养液（购自Invitrogen公 司）中，混勾，室温静止5min;
[0060] (2)将6yl脂质体Lipfectin 2000(购自Invitrogen公司）加入到250iil无血清和双 抗的Grace培养液中，混勾，室温静止5min;
[0061 ] (3)将上述(1)和(2)溶液等体积混合，室温静止20min;
[0062] (4)在上述（3)静止期间，将用6孔板培养好的草地贪夜蛾（Spodoptera ;1^耶1口61(^)5€21细胞系（覆盖孔底面积已经达到70~80%，购自111￥；[1：1'(^611公司）用无血 清和双抗的Grace培养液轻洗三次，然后，每孔加入lml新鲜的Grace培养液，待备用;将(3) 中混合物轻轻加入到每孔细胞中，轻轻混匀，在27 °C条件下静止培养5h;
[0063] (5)将上述(4)每孔中的液体弃掉，加入2ml完全Grace培养液(含有双抗和10 %血 清），27°C条件下静止培养72h，收集细胞上清液，用其感染新培养的Sf21细胞，提高重组杆 状病毒滴度，反复接种2代后，显微镜下观察细胞状态，收取细胞上清液，4°C保存备用;重组 杆状病毒命名为AcMNPV-ORF Cl。
[0064] 结果显示，重组杆状病毒AcMNPV-ORF Cl在Sf21细胞产生明显的细胞病变，空白组 未见病变，结果如图1所示。
[0065] 实施例4鸽圆环病毒样颗粒的表达与鉴定
[0066] 1、间接免疫荧光方法鉴定目的蛋白表达
[0067] 采用间接免疫荧光检测鸽圆环病毒的Cap蛋白表达情况。用AcMNPV-ORF C1感染96 孔板培养的Sf21细胞(培养孔底壁约被细胞覆盖80%)(M0I = 2)，在27°C条件下，细胞静止 培养60h之后，吸掉上清液，轻轻用PBS溶液清洗细胞2次，弃净PBS溶液，每孔加入100yl 80%体积浓度的预冷丙酮，在-20°C条件下，固定Sf21细胞2h，用PBST溶液清洗3次后，细胞 与Cap的多抗（1:500倍稀释)37 °C反应2h;用PBST溶液清洗3次后，细胞与FITC标记的羊抗鼠 二抗IgG 37°C反应lh，用PBST溶液清洗3次后，最后，用荧光显微镜检测实验结果。
[0068] 结果显示，采用Cap多抗作为一抗时，AcMNPV-ORF C1感染的Sf21细胞展现出高强 度的绿色荧光，相比之下，对照组细胞没有绿色荧光出现，表明重组杆状病毒正确表达目的 蛋白，结果如图2所示。
[0069] 2、SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白表达
[0070] 为了分析AcMNPV-ORF C1感染Sf21细胞后病毒样颗粒(VLPs)的表达情况，将重组 杆状病毒以M0I (感染指数）=0.1、1、5感染Sf21细胞，细胞培养72~96h之后，收集细胞，4 °C 保存备用。采用蔗糖密度梯度离心方法纯化VLPs:
[0071] 首先，将培养产物经5000rpm离心20min，收集细胞，然后经25mM NaHC〇3溶液裂解 10min，再经1 X 104rpm离心10min，取沉淀溶解于PBS溶液，加到梯度鹿糖上层液面上，3.5 X 104rpm离心2h，收集在质量体积浓度为10 %~30 %蔗糖液面之间的白带，去除蔗糖，制得鸽 圆环病毒样颗粒。最后，用BCA方法测定蛋白浓度。
[0072] 取100yl获得的蛋白液，加入5X上样缓冲液25yr混匀，煮沸5min，然后，用于SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Western blott检测与分析。在进行Western blot过程中，封闭液采 用质量浓度为5 %的脱脂奶粉溶液，室温封闭时间为2h; -抗采用Cap多抗，室温反应2h;二 抗采用羊抗鼠的HRP标记的IgG，室温反应lh;显色液选用AB混合液，最后，利用LAS-4000系 统照相保存结果。
[0073] SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果显示，目的带在30kDa。
[0074] Western blot结果显示，重组杆状病毒成功表达鸽圆环病毒的结构蛋白Cap (30kDa)、的特异性条带，与预测大小相符，而对照组没有特异性条带出现，表明目的蛋白表 达正确（图3)，鸽圆环病毒Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0075] 3、鸽圆环病毒样颗粒形态的观察与分析
[0076]采用电镜和免疫电镜方法检测与分析鸽圆环VLPs的形态与结构。将纯化的VLPs样 品吸附到金属网上之后，用1%磷钨酸染色3min，然后，用滤纸吸掉金属网上的残余染色液， 最后，利用电镜(JEM 1200EXII)观察与分析并记录实验结果。
[0077]采用免疫电镜进一步观察鸽圆环病毒样颗粒的形态与结构。将培养物上清吸附到 金属网上，用TBST(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，0.05wt%Tween 20，pH7.2)漂洗2次，滤纸吸 净网上残余液后，将GPC单克隆抗体与金属网37°C孵育30min，金属网以同样方法漂洗之后， 与TBST稀释的金颗粒标记的蛋白A(A protein A-gold particles)，直径10nm，37°C孵育 30min，金属网被漂洗和滤纸处理之后，用1 %磷妈酸染色3min，最后，用电镜检测与分析，记 录实验结果。
[0078]电镜结果显示，重组杆状病毒按照一定比例感染的Sf21细胞上清液中，可见到圆 形且具有囊膜的球状VLPs，直径大小在15~18nm范围之内，其形态结构与文献报道的鸽圆 环病毒具有一致性(如图4中A所示）。
[0079]免疫电镜结果显示，病毒样颗粒可以与Cap多抗结合，证明该颗粒存在Cap蛋白（如 图4中B所示）。
[0080] 实施例5病毒样颗粒的免疫原性研究
[0081] 1、病毒样颗粒对小鼠的免疫
[0082]将健康雌性的BALB/c小鼠40只随机分成4组，每组10只小鼠，分别为空白组、VLPs 组、VLPs+Alum组、VLPs+polyl/C组，免疫剂量10yg/只。将纯化的鸽圆环病毒样颗粒样品与 佐剂混合后免疫小鼠。小鼠免疫2次，两次免疫间隔14d，每只小鼠免疫剂量为50yl/只，免疫 方法采用小鼠后肢肌肉注射。在免疫后不同时间，采集小鼠血液和脾脏，用于免疫指标检测 与分析。
[0083] 2、小鼠免疫指标的检测
[0084] (1 )ELISpot对特异性T细胞活化的分析
[0085]在加强免疫后第14d，选用ELISpot实验检测与分析鸽圆环病毒样颗粒特异性T细 胞的免疫活性。首先，96孔ELISpot板用抗鼠IFN-y IgG(5μg/ml)包被，100yl/孔，4°C包被过 夜，细胞板用PBS清洗后，采用10 %牛血清37 °C封闭2h，然后，用PBST洗板，待干后，4 °C保存 备用;每组免疫小鼠的脾细胞被分离后，制成细胞悬液，浓度为5X106/ml;将含有不同刺激 物鹤圆环病毒样颗粒（5μg/ml)或PMA(50ng/ml)和离子霉素（ionomycin) (lμg/ml)的1640细 胞完全培养液加到上述96孔板相应孔中，lOOiil/孔，相同平行组设置3个复孔，其中，鸽圆环 病毒样颗粒作为抗原特异性刺激物，PMA和离子霉素作为阳性对照组刺激物，而阴性对照组 不含有任何刺激物;然后，将上述新制备的脾细胞悬液加到96孔板中（采用1640细胞完全培 养液配制），l〇〇yl/孔，轻轻振荡混匀，细胞在37°C和5%C0 2条件下静止培养24h后，洗掉细 胞，加入生物素标记的检测抗体，37 °C孵育2h，用PBST洗板后，加入辣根过氧化物酶标记的 链霉亲和素溶液，37°C孵育2h，同样细胞板洗完后，加入AEC(3-amin 〇-9-ethylcarbaZ〇le) 底物进行显色，室温避光孵育10_20min，然后，采用酶联斑点图像自动分析仪检测每孔产生 的SFCs(Spot Forming Cells)数量。最后，计算分析1 X 106个脾细胞中能够分泌抗原特异 性IFN-y、IL-4I、L-2的SFCs数量。
[0086]结果表明，二免14d后的小鼠脾细胞被鸽圆环病毒样颗粒特异性抗原刺激后，VLPs +polyI/C组小鼠脾细胞产生的SFCs阳性数量显著高于(p〈0.01)其它免疫组，包括空白组、 VLPs组、VLPs+Alum组，结果如图5所示。
[0087] (3)抗体检测试验
[0088]利用原核表达的Cap蛋白，包被ELISA板。然后，将加热灭活完全的小鼠血清进行倍 比稀释;然后，取每个稀释度的每组免疫小鼠血清分别加到96孔板中，50yl/孔，每个平行组 设3个复孔，37°C反应lh后，洗板3次，然后，在每孔中加入HRP标记的羊抗鼠的二抗（1: 5000 )，振荡混匀，37 °C反应lh后，洗板3次，加入DAB显色液，最后，酶标仪检测结果。
[0089] 结果显示，二免后2周VLPs+polyl/C组小鼠血清在1:600倍稀释时仍为阳性;VLPs+ Alum组为1:500，VLPs组为1:400倍；空白组为阴性。因此，试验结果表明VLPs能够诱导小鼠 产生抗体，结果如图6所示。表明polyl/C佐剂对于鸽圆环病毒样颗粒具有良好的促进作用。 [0090]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种鸽圆环病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的鸽圆环病毒ORF C1基因插入到昆虫细胞表达 载体中，转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，提取阳性质粒，制 得整合了鸽圆环病毒ORF C1基因的重组杆状病毒Bacmid质粒； (2) 将步骤（1)制得的重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得整合了鸽圆环 病毒ORF C1基因的重组杆状病毒； (3) 将步骤(2)制得的整合了鸽圆环病毒ORF C1基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培 养后收获，经纯化制得鸽圆环病毒样颗粒。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)中，昆虫细胞表达载体选 自：AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl_lacZ、BacPAK6、BactoPac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、 BlucBacII、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、 pAcGP67、pAcIE1、pAcJP1、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMP1、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、 pAcRW4、pAc sMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、 pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、 pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、 pPAKl、pPBac、pSHONEX l.l、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL1392、 pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC_5、pFastBacDual、pFastBacl、 pFastBacHT A、pFastBacHT B、pFastBacHT C、pFastBacDual之一或两种以上的混合；进一 步优选的，所述步骤(1)中，昆虫细胞表达载体为pFastBacl。3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)中，重组杆状病毒为重组苜 蓿银纹夜蛾核型多角体病毒rAcMNPV。4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，昆虫细胞选自草地贪夜 蛾（Spodoptera frugiperda)Sf21细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera :1^1^丨。61(^)3€9细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾（3。〇(1(^丨6抑；^1^丨。61(^)]\1;[111；[〇3€9细 胞系、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua)Se 301 细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLGl细胞系、BCIRL/ AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni)BTI-Tn-5Bl-4细胞系、BTI-Tn-5C1 细 胞系、BTI-Tn-5F2细胞系，斜纹贪夜蛾（Spodoptera litura)ZSU-Sl-l细胞系、IBL-SL1A细 胞系、家蚕卵巢细胞系BmN之一；进一步优选的，昆虫细胞选自昆虫细胞选自草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)Sf21 细胞系。5. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，纯化为采用蔗糖密度梯 度离心进行纯化，蔗糖质量体积浓度为10 %、30 %和50 %，单位g/mL。6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，纯化步骤如下： 将培养产物经5000rpm离心20min，收集细胞，然后经25mM NaHC03溶液裂解lOmin，再经1 X 104rpm离心10min，取沉淀溶解于PBS溶液，加到梯度鹿糖上层液面上，3.5 X 104rpm离心 2h，收集在质量体积浓度为10%~30%蔗糖液面之间的白带，去除蔗糖，制得鸽圆环病毒样 颗粒。7. -种鸽圆环病毒样颗粒，包括鸽圆环病毒Cap蛋白；所述的鸽圆环病毒Cap蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示。8. 权利要求7所述鸽圆环病毒样颗粒在制备鸽圆环疫苗中的应用。9. 权利要求7所述鸽圆环病毒样颗粒在制备预防和/或治疗鸽圆环的药物中的应用。10. -种鸽圆环疫苗，其特征在于，疫苗是由权利要求7所述鸽圆环病毒样颗粒为药效 成分与其他辅料复配制得； 根据本发明优选的，所述其他辅料为防腐剂和/或佐剂；进一步优选的，所述佐剂为 poly Ι/C 佐剂。
【文档编号】A61P31/20GK105821012SQ201610343600
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】郑学星, 盖微微, 于学杰, 郑文文, 宋艳艳, 赵丽, 温红玲, 雷晓颖, 王志玉
【申请人】山东大学