一种制备猪圆环病毒2型敏感细胞系的方法、及其制备的细胞系和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品领域，更具体涉及一种猪圆环病毒2型敏感细胞系的制 备方法以及使用该方法制备的细胞系及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒2型（简称PCV2)感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS)、猪 呼吸疾病综合征（PRDC)、猪皮肤和肾病综合征（PDNS)等多种疾病（总称为猪圆环病毒病， PCVDs)，其临床特征为体重逐渐减轻，以及体征例如呼吸急促、呼吸困难和黄疸。从病理学 观点来看，其表现为淋巴细胞或肉芽肿浸润，淋巴结病以及较罕见的肝炎和淋巴细胞或肉 芽肿性肾炎。PCV2感染性疾病引起得死亡率增高、饲料报酬降低，加上我国规模化主场饲养 管理水平相对较为落后，因此PCVD也给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。
[0003] 随着PCV2疫苗的出现，使用PCV2抗原制成的疫苗在对PMWS的预防中初见成效。 随着针对PCV2引起的PMWS及其它疾病的疫苗、诊断试剂和治疗方法的形成与发展，我们需 要有效可靠的方法来获取足量的PCV2病毒。各实验室培养PCV2均在猪肾细胞系PK15上 增殖，但是，其病毒滴度低，病毒含量都低于l(f°TCIDM/ml。经免疫荧光试验显示，受PCV2 感染的PK15细胞比例仅有20% -30%。因为PCV2培养滴度太低，难以获得足够的PCV2 病毒，从而影响了 PCV2研究及其诊断制品和疫苗的研究与开发，为了获得关于疫苗、诊断 试剂和治疗手段的更多信息，进行更为直接有效的研究，因此，就需要获得一种制备持续对 PCV2具有高感染性的敏感细胞系的方法。
【发明内容】
[0004] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种制备猪圆环病毒2型敏感细胞系的方 法以及使用该方法制备的细胞系。
[0005] 本发明的主要目的在于提供一种制备猪圆环病毒2型敏感细胞系的方法，所述方 法包括：（1)将猪肾细胞按照有限稀释法进行细胞克隆和亚细胞克隆，获得亚细胞克隆株； (2)选择对猪圆环病毒2型感染率最高的猪肾细胞的亚克隆株进行细胞培养；（3)将步骤 (2)培养成单层的猪肾细胞亚克隆株加入孵育剂进行孵育；(4)弃去步骤（3)的孵育剂及脱 落细胞；(5)将步骤（4)剩余的贴壁细胞经消化传代，以细胞生长液进行培养，即得猪圆环 病毒2型敏感细胞系。
[0006] 优选地，步骤（1)使用的猪肾细胞为未被猪圆环病毒2型感染的猪肾细胞，经胰蛋 白酶消化为单细胞后进行滴度稀释，分别在37°C 5% C02的条件下培养于96孔细胞培养板 中培养至肉眼可见细胞克隆后，进行亚细胞培养，获得亚克隆细胞株。
[0007] 优选地，步骤（2)为将猪肾细胞亚克隆株接种到96孔细胞培养板中，接种猪圆环 病毒2型于37°C 5% C02的条件下培养2小时，使用间接免疫荧光法检测感染病毒最多的 细胞，选择对猪圆环病毒感染率最高的猪肾细胞的亚克隆株。
[0008] 优选地，步骤（3)所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖；更优选地，所 述的孵育剂为D-氨基葡萄糖；最优选地，所述孵育剂为浓度为300mmol/L的D-氨基葡萄 糖。
[0009] 优选地，步骤（3)所述孵育剂孵育时间为25-35分钟；更优选地，所述的孵育时间 为30分钟。
[0010] 优选地，步骤（5)所述的细胞生长液为含50~100 μ g/mlDEAE-Dextran和5%体 积百分比的胎牛血清的MEM。
[0011] 本发明所用猪肾细胞为PK15细胞。
[0012] 本发明还提供了一种如上所述的猪肾克隆细胞用于高滴度的猪圆环病毒2型的 制备方法，将上述的猪肾克隆细胞用胰蛋白酶消化后，同步接种猪圆环病毒2型，37°C含 5% C02温箱中培养4d，可以观察到细胞病变，表现为细胞聚堆、脱落和拉网，培养至120h细 胞脱落病变可达80%以上，收获即可获得高滴度的猪圆环病毒2型病毒液。
[0013] 优选地，本发明如上所述的收获的高滴度猪圆环病毒2型病毒液滴度为 彡 107.0TCID50/ml。
[0014] 本发明还提供了一种使用所述的猪肾细胞生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法， 所述包括：（1)培养猪肾克隆细胞；（2)增殖病毒；（3)收获病毒，灭活，加入佐剂制备灭活 疫苗。
[0015] 本发明所克隆的细胞系，生物学特性稳定，无细菌、支原体和外源微病毒污染，细 胞纯净。将细胞分散后按Μ. 0.1 . = 0. 1同步接种PCV2后37°C培养4一5天，病毒滴度达 107'°TCID5Q/ml，比PK15细胞的病毒滴度高100倍，且连续传50代后细胞的敏感性和易感性 是稳定的，表明PK15细胞克隆株更利于PCV2的复制和增殖。
【附图说明】
[0016] 图1PCV2在PKK细胞的生长曲线（实时定量PCR)。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0018] 本发明实施例中所用PBS缓冲液如无特别说明，均采用pH7. 4的PBS，配制方法： NaC18. 0g，KC10. 2g，ΚΗ2Ρ04(λ 24g，Na2HP04 · 12Η203· 628g，溶于 800ml 蒸馏水中，用盐酸调 pH 值为7. 4,蒸馏水定容至1000ml，121°C高压灭菌20min，室温保存。
[0019] 本发明所用细胞生长液及细胞维持液为含有50~100 μ g/ml DEAE-Dextran的 MEM 液。
[0020] 本发明所用猪圆环病毒 2 型 SH 株（Porcine Circovirus Type2，strain SH)，在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保 藏号为CGMCC No. 2389,公开于中国专利CN101240264A。
[0021] 实施例1
[0022] 猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备
[0023] 1PK15细胞连续有限稀释进行细胞克隆
[0024] 将保存的无猪圆环病毒1型（PCV1)及2型（PCV2)污染的处于对数生长期的PK15 细胞经胰蛋白酶消化为单个细胞后进行连续梯度稀释，然后分别培养于96孔细胞板，在 37°C 5% C02条件下培养10-14天，挑选有单个细胞生长的细胞孔，将细胞进行亚克隆培养， 并连续亚克隆培养3次，获得亚克隆细胞株。
[0025] 2克隆细胞的病毒敏感试验
[0026] 将PK15细胞不同亚克隆细胞株分别以每孔200 μ L的量加入96孔细胞培养板，置 于37°C 5% C02培养箱中培养12h后，接种PCV2SH株病毒液，每孔接种100 μ L，每个稀释度 重复4个孔，最后每孔补加100 μ L含2%胎牛血清的MEM细胞维持液，于37°C 5% C02条件 下培养48h，同时设立接毒正常PK15细胞对照孔。观察细胞形态，弃去细胞维持液，用PBS 洗细胞3次，经80%冷丙酮固定后，分别加入特异性PCV2抗血清（不与PCV1反应）购自 VMRD 公司（货号 210-70-PCRV)。37°C作用 30min，PBS 洗涤 3 次后加入 FITC-SPA(Boster 公司），37°C作用30min，洗涤后于荧光显微镜下观察特异性荧光细胞，并以未接毒的细胞 作为阴性对照，挑选荧光数量最多（远多于正常PK15细胞荧光数量）的PK15细胞亚克隆 株。
[0027] 3克隆细胞的孵育试验
[0028] 将上述步骤得到的PK15细胞亚克隆株使用细胞生长液培养至形成良好的细胞单 层，换用细胞维持液培养，加入浓度为300mmol/L的D-氨基葡萄糖进行细胞孵育，孵育30 分钟，观察到20% -30%细胞崩解、脱落，弃去孵育剂，并用细胞维持液洗去脱落死亡的细 胞。经胰蛋白酶消化进行传代培养。即得猪圆环病毒2型敏感细胞系，命名为PKK细胞系。
[0029] 实施例2
[0030] 高滴度猪圆环病毒2型的增殖
[0031] 1病毒的增殖
[0032] 将获得的PKK细胞接种于细胞培养瓶内，加入含5%胎牛血清的MEM细胞生长液， 37°C培养72小时可以形成细胞单层后，将细胞用胰蛋白酶消化分散后按Μ. 0.1 . = 0. 1和 细胞同步接种PCV2SH株，加入含2%胎牛血清