CV2病毒攻击，肌肉注射，3Xl(f°TCID5。/ 头，攻毒后第4、7天分别在猪的两腋下及两臀部分四点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙 孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0. 5mg/ml)，4mL/头，腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第 11、19天仅腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。检测指标：（1)分别于首免后14、21、35天 采血，测定ELISA抗体和中和抗体效价，观察抗体产生动态。（2)攻毒后1-20天测量体温， 观察临床症状。（3)组织病理学观察。
[0070] ELISA抗体检测用大肠杆菌表达的PCV2-0RF2蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验 确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，1〇〇 μ 1/孔，37°C作 用2h后4°C包被过夜；洗涤3次，每次3-5min ;每孔加200 μ L的0. 15% BSA封闭液封闭板 子，37°C作用2h ;洗涤；将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μ L，37°C作 用111;洗涤；然后加入酶标的3?4(1:10000倍稀释），10(^17孔，371：作用111 ;洗涤；加底 物液TMB(3'，3'，5'，5'，-四甲基联苯胺）显色，最后用2m〇l/L&H2S0 4终止反应。 结果判定：待检血清〇D45。值/阴性血清0D45。值> 2. 1为阳性。
[0071] 血清中和试验采用固定病毒稀释血清法。待检血清56°C加热30min，lOOOOrpm离 心5min，小心吸出上清，做1:2稀释后进行倍比稀释；分别与等量100TCID5QPCV2病毒液混 合，37°C lh，接种于含PKK细胞单层的96孔板内，100 μ 1/孔，每一稀释度接种4孔，同时设 细胞对照和病毒对照孔。37°C培养12h，用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理，37°C继续培养 48h，80 %丙酮固定细胞，用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制 50%特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组 平均值。
[0072] 按常规方法进行病理解剖，观察脏器病理变化，并采集肺脏、脾脏、淋巴结等脏器 4%福尔马林固定后，制备石蜡切片，HE染色，显微镜观察组织病变。
[0073] 免疫后14天，免疫组能检测到PCV2抗体；首免疫后35天，疫苗免疫组ELISA抗体 和中和抗体效价分别达1:3200和1:32以上，而且，ELISA抗体和中和抗体水平基本一致。 结果见表4。
[0074] 表4仔猪攻毒保护试验抗体检测结果
[0076] 攻毒对照组所有猪攻毒后第1~3周体温升高（>40°C )，持续3~6天，攻毒后第 10天出现被毛粗乱、食欲减退现象，第11天有1头死亡；空白对照猪在整个攻毒期中体温 始终保持正常，无异常临床表现。疫苗免疫的猪，攻毒后第1周有2~3头猪出现体温超过 40°C，持续1~2天，但均未见到明显异常临床表现。疫苗保护效率100%。结果见表5。
[0077] 表5攻毒后20天内猪只临床症状统计结果
[0079] ※：被毛粗乱，皮肤苍白，食欲减退，有死亡现象。
[0080] 为了评价疫苗对猪体的保护效果，我们分别在攻毒前及宰杀时对猪体进行称重， 计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17. 0进行统计分析，结果表明疫苗免疫组 猪相对日增重与空白对照组相似（P = 〇.48>0. 05)，但明显高于非免疫攻毒对照组（P = 0. 02〈0. 05)，证明疫苗均有较好免疫保护作用。
[0081] 攻毒后第11天，攻毒对照猪1头死亡，病理剖解表现为肺脏出血、弹性变低，腹股 沟、髂下、颌下、肠系膜淋巴结肿胀、出血，脾脏边缘轻微出血等。攻毒后第20天，即试验结 束时，扑杀所有试验猪，进行病理解剖和组织病理学检查。试验结果表明非免疫攻毒对照组 猪有明显肉眼病理变化，淋巴结组织中淋巴细胞缺失、巨噬细胞浸润、包涵体病变；肺脏组 织有单核细胞浸润；而免疫猪病理变化很不明显。具体结果见表6。
[0082] 表6攻毒猪病理变化统计结果
[0083]
[0084] 本研究用猪圆环病毒2型灭活疫苗接种仔猪，结果均无异常临床表现，仔猪免疫 后14天产生ELISA抗体和中和抗体，首免后35天攻毒，无异常临床表现和病理变化，免疫 保护效率达1〇〇%，免疫效果良好。
[0085] 以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽 然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人 员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修 饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实 质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将猪肾细胞按照有限稀释法进行细胞克隆和亚细胞克隆，获得亚细胞克隆株； 2) 选择对猪圆环病毒2型感染率最高的猪肾细胞的亚克隆株进行细胞培养； 3) 将步骤2)培养成单层的猪肾细胞亚克隆株加入孵育剂进行孵育； 4) 弃去步骤3)的孵育剂及脱落细胞； 5) 将步骤4)剩余的贴壁细胞经消化传代，以细胞生长液进行培养，即得猪圆环病毒2 型敏感细胞系。2. 根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，步骤 1) 使用的猪肾细胞为未被猪圆环病毒2型感染的猪肾细胞，经胰蛋白酶消化为单细胞后进 行滴度稀释，分别在37°C5%C02的条件下培养于96孔细胞培养板中培养至肉眼可见细胞 克隆后，进行亚细胞培养，获得亚克隆细胞株。3. 根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，步骤 2) 为将猪肾细胞亚克隆株接种到96孔细胞培养板中，接种猪圆环病毒2型于37°C5%C02 的条件下培养2小时，使用间接免疫荧光法检测感染病毒最多的细胞，选择对猪圆环病毒 感染率最高的猪肾细胞的亚克隆株。4. 根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，步骤 (3)所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖；更优选地，所述的孵育剂为D-氨基 葡萄糖；最优选地，所述孵育剂为浓度为300mmol/L的D-氨基葡萄糖。5. 根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，步骤 (3)所述孵育剂孵育时间为25-35分钟；更优选地，所述的孵育时间为30分钟。6. 根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，优选 地，步骤（5)所述的细胞生长液为含50~100μg/mlDEAE-Dextran和5%体积百分比的胎 牛血清的MEM。7. -种使用权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系用于高滴度的猪圆环病毒2 型的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系用胰蛋白酶消 化后，同步接种猪圆环病毒2型，37°C含5%C02温箱中培养4-5d，细胞脱落病变达80%以 上，收获即可获得高滴度的猪圆环病毒2型病毒液。8. 根据权利要求7所述的高滴度的猪圆环病毒2型的制备方法，其特征在于，所述的收 获的高滴度猪圆环病毒2型病毒液滴度为彡l(f°TCIDM/ml。9. 一种使用权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系生产猪圆环病毒2型灭活疫 苗的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 培养猪肾克隆细胞； 2) 增殖病毒； 3) 收获病毒，灭活，加入佐剂制备灭活疫苗。10. -种使用权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系生产的猪圆环病毒2型灭 活疫苗。
【专利摘要】本发明属于兽用生物制品领域，更具体涉及一种猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法以及使用该方法制备的细胞系及其应用。本发明还提供了猪圆环病毒2型敏感细胞系制备高滴度的猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法。本发明提供的猪圆环病毒2型敏感细胞系形态均一、细胞生长速度稳定、生物学特性稳定，能产生高滴度的猪圆环病毒2型，可用于猪圆环病毒2型灭活疫苗和相关诊断试剂的研究和应用。CGMCC No238920080304
【IPC分类】C12R1/91, A61P31/20, C12N7/00, A61K39/12, C12N5/10, C12N7/04, C12N15/85
【公开号】CN105316295
【申请号】CN201410309694
【发明人】张许科, 孙进忠, 姚亚丽, 田克恭
【申请人】普莱柯生物工程股份有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年7月1日