Cik三维环境下的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体是一种CIK三维环境下的制备方法。
【背景技术】
[0002] CIK (cytokine-induced killer，中文名：[自体细胞免疫疗法]多种细胞因子诱 导的杀伤细胞）是单个核细胞在抗CD3单克隆抗体和多种细胞因子的作用下培养获得的一 群异质细胞群，其中CD3+CD56+淋巴细胞是主要效应细胞。CIK可直接杀伤肿瘤细胞和病毒 感染细胞；诱导肿瘤细胞凋亡；通过释放大量炎性细胞因子抑制或杀伤肿瘤细胞。CIK具有 杀瘤活性高、杀瘤谱广、对正常组织毒性低、体外可高度扩增等特点，在临床细胞免疫疗法 中是常用的细胞。
[0003] 然而，现有的CIK制备方法是在培养瓶等2D环境下联合使用多种细胞因子诱导培 养，该培养方法存在细胞增殖效果不佳、细胞活性不足的缺陷。
【发明内容】
[0004] 为解决现有CIK制备方法存在细胞增殖效果不佳、细胞活性不足的缺陷，本发明 提供一种显著增加细胞的扩增倍数，细胞活性更强的CIK的制备方法。
[0005] 实现上述目的技术方案是，本发明提供的一种CIK三维环境下的制备方法，
[0006] 该方法包括如下步骤，
[0007] 取抑肽酶溶解纤维蛋白原，获得溶液A ;
[0008] 配制含有凝血酶的溶液B;
[0009] 获取单个核细胞，并将所述单个核细胞与溶液A和溶液B三者混合，获得预诱导混 合物；
[0010] 再对所述预诱导混合物中的单个核细胞进行诱导培养，生成CIK。
[0011] 在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述单个核细胞的浓度为 1*102-106个/ml，所述抑肽酶的浓度为1000-3000KIU/ml ;所述溶液A中，纤维蛋白原的浓 度为1. 5~3. 5g/L ;所述溶液B中凝血酶的浓度为250-400U/ml。
[0012] 在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述单个核细胞的浓度为1*104个/ml，所述抑肽酶的浓度为2000KIU/ml ;所述溶液A中，纤维蛋白原的浓度为2. Og/L ;所 述溶液B中凝血酶的浓度为300U/ml。
[0013] 在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述单个核细胞的浓度为1*102个/ml，所述抑肽酶的浓度为1000KIU/ml ;所述溶液A中，纤维蛋白原的浓度为1. 5g/L ;所 述溶液B中凝血酶的浓度为250U/ml。
[0014] 在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述单个核细胞的浓度为1*106个/ml，所述抑肽酶的浓度为3000KIU/ml ;所述溶液A中，纤维蛋白原的浓度为3. 5g/L ;所 述溶液B中凝血酶的浓度为400U/ml。
[0015] 在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述溶液B由凝血酶和可溶性钙 盐溶液共同配制而成。
[0016] 在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述可溶性钙盐为CaCl2，且CaCl 2溶液的浓度为30-50mmol/L。
[0017] 在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，单个核细胞与溶液A和溶液B混 合后置于10-40 °C至凝固。
[0018] 在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述预诱导混合物中的单个核细 胞的诱导培养过程为：
[0019] 将预诱导混合物置于含有抗⑶3单克隆抗体和RetroNectin预包被的培养器皿 中，并加入含PPP和IFN- γ的培养基进行培养；
[0020] 再添加生长因子IL-1 α和IL-2继续培养至单个核细胞转化成CIK。
[0021] 在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述抗CD3单克隆抗体的浓度为 10_150ng/ml，RetroNectin 的浓度为 10_50g/ml〇
[0022] 在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述培养基中PPP的体积分数为 0· 5-2%，IFN-γ 的浓度为 500-1500IU/ml。
[0023] 在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述IL-la在培养基中的浓度为 50-150IU/ml，IL-2 在培养基中的浓度为 100-500IU/ml。
[0024] 本发明的有益效果是：将所述单个核细胞与溶液A和溶液B三者混合，得到一个纤 维蛋白凝胶状态环境，纤维蛋白凝胶能够模拟体内细胞的三维生长环境，为单个核细胞提 供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，从而更有利于单个核细胞转化为CIK并 能够促进CIK的生长，可显著增加 CIK的扩增倍数，获得的细胞活性也更强。
【附图说明】
[0025] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0026] 图1为通过本发明提供的CIK制备方法实施例1所获得细胞分布图；
[0027] 图2为通过现有的CIK制备方法所获得的细胞分布图。
【具体实施方式】
[0028] 为解决现有CIK制备方法存在细胞增殖效果不佳、细胞活性不足的现象，本发明 在制备纤维蛋白凝胶的过程中加入单个核细胞，将单个核细胞裹覆于纤维蛋白凝胶中，再 进行诱导成CIK，而纤维蛋白凝胶特殊的立体结构，可以更好地模拟体内细胞的生长微环 境，从而为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，经该方法制备CIK，可 显著增加 CIK的扩增倍数，获得的细胞活性更强。
[0029] 具体地，本发明提供的CIK三维环境下的制备方法，包括如下步骤：
[0030] 1、取抑肽酶溶解冻干纤维蛋白原，获得溶液A ;
[0031] 2、将凝血酶加入可溶性钙盐溶液中，获得溶液B ;
[0032] 3、获取单个核细胞，并将单个核细胞与溶液A和溶液B三者混合置于10_40°C至凝 固状，获得预诱导混合物；
[0033] 4、再对预诱导混合物中的单个核细胞进行诱导培养，生成CIK。
[0034] 其中，凝血酶能够酶切纤维蛋白原，释放出纤维蛋白A肽及B肽，使之形成了纤维 蛋白单体，纤维蛋白单体可由氢键及静电引力作用聚合成不稳定的可溶性纤维蛋白纤维； 凝血酶同时还能够激活因子，在钙离子存在下参与纤维蛋白多肽的交联，使纤维蛋白纤维 和多肽形成坚固不易降解的凝块，使之结构更加稳定，即形成纤维蛋白凝胶；而抑肽酶又能 够防止纤维蛋白凝胶中的蛋白酶解，使得附着在纤维蛋白凝胶上的细胞不易脱落。
[0035] 而本发明将上述溶液A和溶液B混合的同时加入单个核细胞，即在纤维蛋白凝胶 的形成的同时，将单个核细胞均匀裹覆于纤维蛋白凝胶中，而由于纤维蛋白凝胶呈立体状 的固化物，且具有良好的生物相容性，是一种高分子网络体系，具有三维的孔隙结构，这些 孔隙不仅使细胞能自由的迀移、增殖，还为细胞所需营养的渗透提供了基础；细胞在纤维蛋 白凝胶内均匀分布，不易被体液冲走、降解，并能有效地黏附多种生长因子，利于细胞的再 生；除此之外，由于未凝固的纤维蛋白凝胶有流动改变形态的趋势，不利于细胞均匀的接触 到氧气和细胞因子，同时流动的纤维蛋白凝胶对细胞会产生剪切力，造成细胞的损伤；因 此，本发明在将单个核细胞与溶液A和溶液B混合后置于10-40°C下使纤维蛋白凝胶完全凝 固；利用纤维蛋白凝胶的立体结构模拟体内细胞的生长微环境，从而增大了单个核细胞与 细胞生长因子和氧气的接触面积，为单个核细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的 空间结构，提高单个核细胞的转化率，从而提高CIK的数量，增强CIK的活性。因此，本发明 采用的纤维蛋白凝胶能够为单个核细胞提供一个适宜生长转化的立体环境。
[0036] 进一步地，步骤1中抑肽酶的浓度为1000-3000KIU/ml，取1ml抑肽酶溶解冻干纤 维蛋白原，并使纤维蛋白原在溶液A中的终浓度为1. 5~3. 5g/L即可；
[0037] 步骤2中凝血酶的浓度为100_500U/ml ;优选地，可溶性钙盐溶液为CaCl2溶液，其 浓度为30-50mmol/L ;溶液B中，凝血酶的浓度为250-400U/ml ;
[0038] 需要特别注意的是，溶液A和溶液B的制备过程必须要使用不同的器皿，以防止共 用同一器皿，提前形成纤维蛋白凝胶，影响单个核细胞的附着。
[0039] 步骤3中，本发明优先采用从血液中分离获取单个核细胞，具体过程为：
[0040] A.取100ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml的无菌离心管中， 300g离心10min，将所有的上层血浆转移到2个新的无菌离心管中，56°C水浴灭活30min，再 于400g离心10min后，收集上层黄色液体即低血小板血衆（Poor Platelet Plasma，PPP)， 4 °C储存备用；
[0041] B.向该4个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，直到每管30ml混合 液，用移液器混匀，再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将血细胞混合 液用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层，400g离心20min ;
[0042] C.吸取中间白膜层至新的50ml离心管中，用生理盐水补液到45ml后，离心洗涤单 个核细胞2次，获取单个核细胞液，优选地，单个核细胞的浓度为1*102-106个/ml。
[0043] 步骤4中，对预诱导混合物中的单个核细胞的诱导培养过程为：
[0044] 1)将带有单个核细胞的预诱导混合物置于⑶3McAb(抗⑶3单克隆抗体）和 RetroNectin(重组人纤维蛋白片段）预包被的培养器皿中，并加入含PPP和IFN-γ (γ干 扰素）的培养基；
[0045] 2)第2天，添加 Ε-1 α (白介素 1 α )和几 -2培养，即可收获CIK ;
[0046] 步骤1)中，采用浓度为10_150ng/ml的CD3McAb和浓度为10-50g/ml的 RetroNectin预包被培养器皿，具体预包被过程为现有技术，在此不再赘述。优选地，培养 基为GTT551培养基，且GTT551培养基中PPP的体积分数为1 %，IFN- γ的浓度为1000IU/ ml。CD3McAb和RetroNectin均可刺激单个核细胞生长，与PPP和IFN- γ细胞生长因子配 合可促进单个核细胞转化为CIK。
[0047] 步骤2)中，添加细胞生长因子IL-1 α和IL-2,并使其在培养基中的终浓度分别 为：50-150IU/ml、100-500IU/ml。IL-la 与 IFN-γ 和 CD3McAb 合用时，可以明显提高 CIK 的 细胞毒活性；而IL-2用于促进CIK的增殖。
[0048] 进一步地，在步骤2)之后，还可以继续对CIK进行培养增殖，以达到临床回输治疗 病人的需求，具体步骤为：
[0049] 3)第3天，补充步骤1)中的培养基，同时添加 IL-2,维持IL-2在培养基中浓度不 变，对CIK进行扩增；
[0050] 4)每隔2-3天重复步骤3);
[0051] 5)第14-21天，收获增殖后的CIK。
[0052] 可以理解的是，以上对带有单个核细胞的预诱导混合物的培养方法，仅为本发明 提供的其中一种培养方法，现有技术中，CIK的诱导培养方法均可适用于本发明。
[0053] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0054] 实施例1
[0055] 本发明提供的一种CIK三维环境下的制备方法，包括以下步骤：
[0056] (1)配制2000KIU/m