本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种雷公藤红素柔性脂质体、凝胶及其制备方法。
背景技术：
雷公藤红素(celastrol)是从卫茅科雷公藤属植物雷公藤(triperygiumwilfordiihookf.)中分离提纯得到的五环三萜醌结构的化合物。雷公藤红素不溶于水，易溶于二甲基亚砜、氯仿、丙酮和乙醚。具有较强的抑制免疫反应、抗炎及抗癌作用，可以用于多种自体免疫、慢性炎症疾病及癌症治疗，包括银屑病、特应性皮炎、皮肤癌、乳腺癌、全身性红斑狼疮及慢性类风湿性关节炎等。虽然雷公藤红素抑制免疫反应、抗炎症及抗癌的作用较好，但雷公藤红素不溶于水，口服胃肠道吸收较差，加之雷公藤红素毒性较大，口服会产生全身性的毒副作用，主要表现为：对胃肠道存在刺激作用、甚至出现严重的肠道毒性；对中枢神经系统包括视丘、中脑、延髓、小脑及脊髓产生损害；引起肝、心的出血与坏死等。且口服制剂存在肝脏的首过效应，生物利用度低。采用经皮给药方式可提高局部药物浓度，避免口服给药等引起的血药浓度峰谷现象，降低口服给药后产生的全身性的毒副作用；其次，可避免肝脏的首过效应，生物利用度高；此外，可减少给药次数、延长给药间隔，使用方便，可随时中断给药，减少耐药性，对降低药物尤其是有毒药物的毒副作用、提高药物的治疗效果具有重大的临床应用价值。
纳米结构脂质载体(nanostructurelipidcarriers，nlc)是将固体脂质和空间上不相容的液体脂质在一定温度下混合制备得到的纳米粒给药载体。通过形成一些含纳米隔室的脂质骨架，提高药物载药量，避免储存过程中药物被排挤，与传统载体系统(如脂质体、微球、固体脂质纳米粒等)相比，其具有更高的载药能力及降低储藏过程包封药物泄漏的优点。研究发现将纳米结构脂质载体用于经皮给药，具有生物相容性好，对皮肤无刺激作用；纳米级颗粒能提高角质层的水合程度，促进药物透过；具有缓释作用；可以提高难溶性药物生物利用度并极大地降低药物因口服产生的毒性。
现有的雷公藤红素脂质体药物存在的制备过程复杂，使用的辅料种类繁多，部分辅料刺激性较强，以及制备得到的雷公藤红素脂质体包封率不够理想的缺陷。
技术实现要素：
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种复方雷公藤红素柔性脂质体。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
一种雷公藤红素柔性脂质体，由如下成分组成：
优选地，所述雷公藤红素柔性脂质体由如下成分组成：
本发明的第二目的在于提供一种雷公藤红素柔性脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)精密称取计量份蛋黄卵磷脂、胆固醇及雷公藤红素于容器中，加入适量有机溶剂使得雷公藤红素完全溶解，充分溶解摇匀后，旋转蒸发去除有机溶剂；所述有机溶剂为甲醇、乙醇或氯仿；
(2)加入计量份胆酸钠溶液，充分水合后，冰浴下进行超声得到复方雷公藤红素柔性脂质体混悬液。
优选的，所述有机溶剂的用量为雷公藤红素质量的200～400倍。
优选的，所述胆酸钠溶液的浓度为2～4mg/ml。
优选的，所述步骤(2)中的超声功率为120～280w，重复超声10次，工作2s，间隔2s。
优选的，所述步骤(2)得到的雷公藤红素柔性脂质体混悬液中雷公藤红素的浓度为1～3mg/ml。
本发明的第三目的在于提供一种复方雷公藤红素柔性脂质体凝胶，由如下成分组成：
优选地，所述复方雷公藤红素柔性脂质体凝胶由如下成分组成：
本发明的第四目的在于提供一种复方雷公藤红素柔性脂质体凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取计量份卡波姆固体，加入到纳米银溶液中，搅拌下使得卡波姆固体全部溶解；
(2)在步骤(1)得到的溶液中加入前述雷公藤红素柔性脂质体混悬液，并补加入纯水直至满足计量比，搅拌均匀即得复方雷公藤红素柔性脂质体凝胶。
优选地，所述纳米银溶液中纳米银的浓度为100～220μg/ml。
本发明还提供了一种雷公藤红素含量测定方法的建立(hplc法)：
色谱柱：agilenteclipsexdb-c8柱(250mm×4.6mm,5μm)
流动相：甲醇-5％醋酸(92:8)
流速：1ml/min
检测波长：425nm
柱温：30℃
运行时间：8min
结果：雷公藤红素在色谱柱上的保留时间为6.2min，峰形较好，标准曲线：c＝0.0337a-0.0365，线性范围为0.1～50μg/ml，可用于含量测定。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
通过本发明的方法制备得到的雷公藤红素柔性脂质体生产过程操作、安全，粒径和包封率均较为理想，物理稳定性良好；得到的雷公藤红素柔性脂质体混悬液可直接用于制备复方雷公藤红素柔性脂质体凝胶，无需经过分离纯化的步骤。此外，通过本发明的方法制备得到的复方雷公藤红素柔性脂质体凝胶对大鼠烫伤创面具有较好的促愈合作用。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
主要实验用仪器和试剂如下：
高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司
超声波细胞破碎仪：scientz-750f，宁波新芝生物科技股份有限公司
激光粒度测定仪：nano-zs，英国马尔文仪器有限公司
透皮吸收仪：hc-188，天津市正通科技有限公司
即用型透析袋(10kmwco)：thermofisherscientificinc.
高纯蛋黄卵磷脂(pc-98t)：上海艾韦特医药科技有限公司
高纯度胆固醇：上海艾韦特医药科技有限公司
胆酸钠：国药集团化学试剂有限公司
氯仿、甲醇、乙醇：国药集团化学试剂有限公司
吐温80：国药集团化学试剂有限公司
卡波姆：美国路博润公司
雷公藤红素：aktinchemicals,inc.
纳米银原液(220μg/ml)，华绣科技有限公司
包封率的测定：取脂质体混悬液1ml，加入sephadexg-50葡聚糖凝胶柱，以纯水洗脱，每2ml收集一管，比浊法(300nm)测定脂质体浓度，绘制洗脱曲线。收集脂质体部分流出液，以甲醇适当稀释后进hplc检测药物浓度，计算包封率。包封率计算公式如下：
包封率(％)＝(脂质体中包封的药物/脂质体中药物总量)×100％。
精密称取0.2g蛋黄卵磷脂、0.025g胆固醇及及0.01g雷公藤红素于梨形瓶中，加入2ml甲醇，充分溶解摇匀后，40℃、10rpm条件下旋转蒸发去除有机溶剂，加入5ml胆酸钠溶液(4mg/ml)，充分水合，冰浴超声10次(200w，工作2s，间隔2s)，得到雷公藤红素柔性脂质体混悬液5ml。所得雷公藤红素柔性脂质体平均粒径为118.7nm，pdi为0.240，zeta电位为-31.8mv，包封率为99.9％，脂质体载药量为4.1％。于4℃冰箱放置2周后，粒径和包封率无明显变化，说明脂质体物理稳定性良好。
精密称取卡波姆固体0.05g，加入到4.545ml纳米银原液(220μg/ml)中，搅拌溶解，向该溶液中加入0.405ml纯水、5ml雷公藤红素脂质体混悬液(含雷公藤红素2mg/ml)，搅拌均匀即得复方脂质体凝胶。
实施例2
精密称取0.2g蛋黄卵磷脂、0.05g胆固醇及及0.01g雷公藤红素于梨形瓶中，加入2ml乙醇，充分溶解摇匀后，40℃、10rpm条件下旋转蒸发去除有机溶剂，加入5ml胆酸钠溶液(3mg/ml)，充分水合，冰浴超声10次(120w，工作2s，间隔2s)，得到雷公藤红素柔性脂质体混悬液5ml。所得雷公藤红素柔性脂质体平均粒径为110.2nm，pdi为0.226，zeta电位为-32.6mv，包封率为99.7％，脂质体载药量为4.2％。于4℃冰箱放置2周后，粒径和包封率无明显变化，说明脂质体物理稳定性良好。
精密称取卡波姆固体0.1g，加入到4.495ml纳米银溶液(100μg/ml)中，搅拌溶解，向该溶液中加入0.405ml纯水、5ml雷公藤红素脂质体混悬液(含雷公藤红素2mg/ml)，搅拌均匀即得复方脂质体凝胶。
实施例3
精密称取0.2g蛋黄卵磷脂、0.05g胆固醇及及0.01g雷公藤红素于梨形瓶中，加入2ml氯仿，充分溶解摇匀后，40℃、10rpm条件下旋转蒸发去除有机溶剂，加入5ml胆酸钠溶液(2mg/ml)，充分水合，冰浴超声10次(280w，工作2s，间隔2s)，得到雷公藤红素柔性脂质体混悬液5ml。平均粒径为114.8nm，pdi为0.230，zeta电位为-33.1mv，包封率为99.8％，脂质体载药量为4.3％。于4℃冰箱放置2周后，粒径和包封率无明显变化，说明脂质体物理稳定性良好。
精密称取卡波姆固体0.025g，加入到4.57ml纳米银溶液(120μg/ml)中，搅拌溶解，向该溶液中加入0.405ml纯水、5ml雷公藤红素脂质体混悬液(含雷公藤红素2mg/ml)，搅拌均匀即得复方脂质体凝胶。
实施例4复方脂质体凝胶的体外释放实验
复方脂质体凝胶的体外释放实验：将裁剪合适的透析袋置于透皮吸收仪接收池顶部，并固定在扩散池和接收池之间。接收池(5ml，ф9mm)中加入含0.1％吐温80的磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)，设定温度为37℃和转速为300r/min。在扩散池中加入0.2g复方脂质体凝胶，分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24h取样0.5ml，并补充0.5ml新的释放介质。hplc测定样品中雷公藤红素浓度，计算单位面积累积释放量。
表1
实施例5大鼠烫伤创面的促愈合试验
(1)受试药物及试剂：
水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司，批号：20151023；
0.02mpbs(ph6.8)：500ml/瓶，武汉谷歌生物科技有限公司；
4％多聚甲醛：500ml/瓶，武汉谷歌生物科技有限公司，g-1002；
甲醛溶液：500ml/瓶，国药集团化学试剂有限公司，批号：20160503；
乙醇：500ml/瓶，国药集团化学试剂有限公司，批号：20160627；
0.9％氯化钠注射液：浙江天瑞药业有限公司，规格：500ml:4.5g，批号：716022605；
hangping,electronicbalance分析天平：型号ja5003n；
h-600透射电子显微镜：日本日立公司；
医用脱脂纱布：上海宏隆医疗用品设备有限公司，批号：151112；
一次性护理口罩：上海宏隆医疗用品设备有限公司，批号：150804；
如意无粉乳胶手套：海门市如意实验器材厂，批号：160606；
剪刀、镊子等手术实验用品均购自第二军医大学教保处；
一次性使用无菌注射器带针(1ml、2ml、5ml)：上海康德莱企业发展集团股份有限公司，批号：k20160318；
科德士宠物专用电推剪：cp-8000；
电子数显卡尺：上海量具刃具厂；
yp1201n电子天平：上海精密科学仪器有限公司；
canon数码相机：860is；
阳性对照药：重组纳米银抗菌凝胶(斯丽凯)(深圳市源兴纳米医药科技有限公司，批号：150508021)。
(2)动物
来源、种属、品系：sd大鼠，spf级，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。
许可证号码：scxk(沪)2013-0016。
体重：180-200g
性别：雄性
动物总数：42只
每组动物数：6只
饲养条件:室温20～25℃，湿度40～70％，标准饲料，动物自由饮食和饮水。
(3)剂量设置：设置正常组、生理盐水组(模型组)、空白凝胶组(100μl/创面)、纳米银凝胶组(100μl/创面)、脂质体凝胶组(100μl/创面)和复方凝胶组(100μl/创面)。复方凝胶组为实施例1制备得到的复方脂质体凝胶，空白凝胶组为卡波姆浓度为0.5％的未添加药物的凝胶，纳米银凝胶组为卡波姆浓度为0.5％、纳米银终浓度100μg/ml的凝胶，脂质体凝胶组为卡波姆浓度为0.5％、雷公藤红素终浓度为1.0mg/ml的凝胶。
(4)试验对照
生理盐水组(模型组)为裸露创面；阳性对照组给予重组纳米银抗菌凝胶(斯丽凯)(100μl/创面)。
(5)试验主要步骤：
为避免皮肤创伤后细菌感染带来的影响，实验全程在第二军医大学药学院ivc屏障系统房间进行。取sd大鼠42只，除正常组6只大鼠外，其余大鼠用10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉后，背部去毛，经消毒后在大鼠背部用yls-5q台式超级控温烫伤仪烫1个直径2cm圆形深ii度烫伤创面创面(98℃，10s)。36只大鼠随机分为生理盐水组(模型组)、空白凝胶组、纳米银凝胶组、脂质体凝胶组、复方凝胶组和阳性对照斯丽凯组，每组6只。皮肤创面形成2h后给药治疗，所有大鼠单笼饲养。除正常组不作处理外，其他创面分别给予不同药物100μl，每天处理1次，连续给药21天。
检测指标包括:
a.伤口面积：治疗前，治疗3天、7天、10天、14天、17天和21天，将每只大鼠创面在相同条件下拍数码照片，用塑料透明纸描记创面，扫描仪扫描图片后，游标卡尺测量后，计算其伤口面积；
b.病理组织学：给药21天后，10％水合氯醛麻醉大鼠，取3个大鼠割伤创面皮肤，一部分切成1mm3大小组织，用4％多聚甲醛保存待做透射电镜检查伤口部位皮肤组织的超微结构变化；所有大鼠皮肤用10％甲醛液固定，常规脱水、石蜡包埋切片、he染色，光镜下观察伤口部位皮肤的组织病理学变化；
c.创面组织生化指标：所有大鼠取全层皮肤组织100mg左右，有痂皮者先去除痂皮，在4℃生理盐水中漂洗，去除血液，用滤纸拭干后称重。在冰浴中将组织剪碎后置于玻璃匀浆管中，充分研碎，使组织匀浆化；加入组织重量9倍的冰冷生理盐水，研磨成10％组织匀浆，随后将匀浆液以3000r/min速度离心10min，吸取上清液；将考马斯亮蓝显色剂加入蛋白样品中，通过测定吸光度值测定蛋白含量；然后按试剂盒说明，采取分光光度法测定样品管的吸光度值，以反映创面组织sod活性、丙二醛(malonaldehyde,mda)含量的变化。试验数据用_x±s表示，两组间比较采用t检验比较差异的显著性。显著性水平a＝0.05。
(6)试验结果
a.伤口面积：与空白对照组比较，连续给药21天后，复方凝胶组、纳米银凝胶组和阳性对照斯丽凯组均可使大鼠烫伤面积显著减小(p<0.05，p<0.01)。结果见表2；
表2复方凝胶对大鼠烫伤创面(mm2)的影响(_x±s,n＝6)
*p<0.05，**p<0.01vs生理盐水组
b.病理组织学：透射电镜结果显示：正常组：正常上皮细胞结构；生理盐水组(模型组)：未见上皮，胶原结构紊乱，可见大量变形细胞和空泡，未见上皮；空白凝胶组：可见上皮，上皮细胞内可见少量空泡；纳米银凝胶组：可见少量较幼稚的新生上皮，胶原排列整齐；脂质体凝胶组：上皮细胞结构基本正常，胶原纤维排列整齐；复方凝胶组：上皮细胞结构基本正常，少数细胞核周间隙扩张；纳米银抗菌凝胶组：基本正常上皮细胞结构。
c.创面组织生化指标：按试剂盒说明，采取分光光度法测定样品管的吸光度值，检测反映创面组织sod活性、丙二醛(malonaldehyde,mda)含量变化。与空白对照组比较，连续给药21天后，复方凝胶组、纳米银凝胶等和阳性对照斯丽凯组大鼠皮肤sod活力均有不同程度增加，mda活力不同程度降低。结果见表3。
表3复方凝胶等对大鼠sod和mda的影响(_x±s)
与空白对照组(模型组)比较，给复方凝胶组(cm)和纳米银凝胶各组、阳性对照纳米银抗菌凝胶21天后，均促进大鼠烫伤创面的愈合，显著减小烫伤面积(p<0.05，p<0.01)；大鼠皮肤sod活力均有不同程度增加，mda活力不同程度降低，其中斯丽凯组和纳米银凝胶组效果最好；通过透射电镜结果显示：各给药组可以减轻大鼠烫伤后皮肤胶原结构紊乱，上皮下可见大量变形细胞和空泡，未见上皮等症状；病理结果显示：空白对照组(模型组)表皮坏死脱落，有溃疡，皮肤结构紊乱；各给药组表皮不规则生长，部分可见皮肤附属器存在，可见药物对皮肤具有一定的治疗作用。试验结果表明：复方凝胶对大鼠烫伤创面具有较好的促愈合作用。
实施例6小鼠的急性毒性试验
试验参照1999年国家药品监督管理局颁发的《中药新药药理毒理研究的技术要求》和2005年颁布的《中药、天然药物急性毒性试验技术指导原则》进行。根据复方脂质体凝胶在临床应用的给药途径为皮肤给药，试验选择对小鼠进行灌胃给药。小鼠给药后观察14天，记录其毒性反应、体重变化及死亡情况。
(1)试验动物
种属：icr小鼠
性别：雌雄各半
体重：18～22克
数量：40只
来源：上海市西普尔-必凯实验动物有限责任公司
实验动物许可证号码：scxk(沪)2013-0016
(2)试验方法
给药途径：小鼠单次灌胃，给药前禁食不禁水12h；
给药容量：按最大给药容量40ml/kg体重给药；
给药剂量：小鼠灌胃实施例1制备得到的复方脂质体凝胶40ml/kg体重；阴性对照组给40ml/kg体重的空白凝胶，空白凝胶为卡波姆浓度为0.5％的未添加药物的凝胶；
观察指标：观察给药后14天内小鼠的中毒及死亡情况，未死亡小鼠于第7、14天分别称重，第14天称重后处死，解剖，检查各主要脏器是否有病变。
统计学处理：体重数据用_x±sd表示，数据用spss17.0软件进行处理，采用单因素方差分析(one-wayanova)检验；显著性水平a＝0.05。
(3)试验结果
给小鼠单次灌胃实施例1制备得到的复方脂质体凝胶40ml/kg体重后，小鼠的一般行为活动、饮食、皮毛及其它情况未见异常，未见明显毒性反应。给药小鼠在给药后一般行为活动、饮食、皮毛及其它情况未见异常；给药后第14天称重后处死小鼠，进行大体解剖，肉眼观察未见器官出现体积、颜色、纹理改变；具体数据见表4。单次灌胃小鼠复方脂质体凝胶的最大耐受剂量为40ml/kg。
表4单次灌胃icr小鼠复方脂质体凝胶40ml/kg体重后小鼠的体重变化
注：同性别与对照组比较p均＞0.05
实施例7新西兰兔皮肤刺激性试验
试验参照2005年3月颁布的《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》进行。复方脂质体凝胶(棕黄色)临床应用途径为皮肤愈合，本试验选择复方脂质体凝胶(棕黄色)对兔正常皮肤涂抹给药，观察72h内给药部位皮肤的变化。
(1)试验动物
种属：新西兰兔
性别：雌雄各半
体重：2.0～2.5kg
数量：6只，雌雄分别随机分组，共分2组
来源：上海甲干生物科技有限公司提供，普通级
动物合格证号：scxk(沪)2013-0007号
饲养条件：标准饲料，动物自由饮食和饮水。实验前适应性饲养3天。动物饲养于清洁级环境，室温20-25℃，日温差≤3℃，换气次数10-20次/h，湿度40-70％，压强梯度20-50pa，昼夜明暗交替时间12h/12h。
(2)试验方法：
取新西兰兔6只，雌雄各半，均采用自身对照进行试验。试验前24h新西兰兔背部去毛，呈前后2个去毛区域，每个去毛区域的范围约为3cm×3cm，检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤。去毛区域的皮肤保持无损伤，左侧给实施例1制备得到的复方脂质体凝胶，右侧给阴性对照空白凝胶(卡波姆浓度为0.5％的未添加药物的凝胶)。将复方脂质体凝胶和空白凝胶直接均匀涂抹在给药区域，用二层纱布(2.5cm×2.5cm)贴敷创面，再用无刺激性医用胶布加以固定，贴敷4h后，用温水冲洗清洁受试物部位，分别于45min、3h、24h、48h和72h肉眼观察去毛皮肤反应情况，并记录受试部位皮肤有无红斑和水肿等。按表5对皮肤刺激反应进行评分。
剂量设置：500ul/创面
给药途径：涂抹给药。
给药次数：均单次给药
观察指标及观察时间：观察复方脂质体凝胶对家兔皮肤反应情况。观察时间分别为45min、3h、24h、48h和72h。
结果评价：计算每一观察时间点各组受试物皮肤反应积分的平均分值，按表6进行刺激强度评价。
表5皮肤刺激反应评分标准
表6皮肤刺激强度评分标准
(3)结果：
空白凝胶组正常皮肤部位无红斑、水肿情况。复方脂质体凝胶对正常皮肤无影响，不引起正常皮肤红斑、水肿，评分均为0。对正常皮肤刺激反应平均评分情况见表7。
表7复方脂质体凝胶对正常皮肤刺激反应平均评分情况(x±sd，n＝6)
结论：复方脂质体凝胶对正常皮肤无刺激性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。