专利名称：一种测定雷公藤多苷效价的方法
所属技术领域本发明用于测定雷公藤多苷的免疫控制效价，特别是一种通过检测小白鼠胸腺萎缩程度来测定雷公藤多苷效价的方法。
背景技术：
雷公藤多苷是用于治疗类风湿性关节炎的首选临床药物，它是从卫矛科植物雷公藤根中提取出来的一些次代谢产物的混合体，成分复杂，毒性大。国家至今尚未制订出一个控制其质量好坏的检测标准，生产雷公藤的厂家通常都采用LD50测定法来控制毒性。半数致死量(简称LD50)是指药物引起实验动物半数死亡的剂量。由于个体差异，同一剂量的药物给同一动物，可以出现死亡或不死亡。而LD50在表示药物毒性时，比较灵敏，准确。一般以mg/kg表示(药物剂量/体重)。测定LD50常用动物为小白鼠，体重18-22g，雄雌均可(雌的不得怀孕)将不同性别和体重的动物均匀分成4或6组，每组10只。给药途径和临床应用相同，给药容量不超过0.6ml为宜。一般观察7天，以死亡为主要指标。但实验证明毒性相同的两批雷公藤多苷产品其效价有很大的区别，仅靠LD50测定法不能测定雷公藤多苷的效价，无法确保生产的雷公藤多苷低毒高效。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服单纯依靠LD50测定法控制雷公藤多苷质量，难以区分毒性相同的不同批次雷公藤产品的效价比的缺陷，提供一种通过检测小白鼠胸腺萎缩程度测定雷公藤多苷效价的方法，将生物效价法和LD50法结合起来，控制雷公藤多苷的质量，使生产的雷公藤多苷低毒高效。
本发明解决现有技术问题所采用的技术方案是一种测定雷公藤多苷效价的方法，其特征是首先对一批次的多组小白鼠分别进行氢化可的松和雷公藤多苷的注射，寻求导致小白鼠胸腺萎缩呈线性关系的剂量范围；接着在该剂量范围对同一批次的多组小白鼠分别进行氢化可的松和雷公藤多苷的注射，连续数天给药后，称重，将小白鼠断颈处死，剖取胸腺称重，计算比较两者的胸腺指数。以注射氢化可的松的小白鼠胸腺为参照确定雷公藤多苷的效价，所述的胸腺指数＝[胸腺(mg)/100g体重]的平方根。实验证明雷公藤多苷在小剂量时对幼年小鼠胸腺无明显影响，大剂量时才能使胸腺萎缩。本发明通过对小白鼠分组进行氢化可的松和雷公藤多苷的注射，使小白鼠胸腺萎缩，将小白鼠处死后取出胸腺称重，求出胸腺指数；以注射氢化可的松的小白鼠胸腺指数为基准，比较雷公藤多苷的生物效价。
本发明中所述的实验小白鼠随机分成四或六组，其中二分之一组注射氢化可的松，剂量范围为16.4mg/kg～40mg/kg；另二分之一组注射雷公藤多苷，剂量范围为64mg/kg～125mg/kg。
本发明中所述的小白鼠为出生18～20日龄，体重11～13g，胸腺为67mg～77mg的ICR幼鼠。因为幼鼠体重及胸腺重量都是随着日龄的增加而增加，并且18日龄、19日龄及20日龄时幼鼠胸腺指数趋向平衡，有利于实验，减小胸腺指数相差太大带来的不利影响。经过大量实验检测表明符合该日龄和体重的ICR幼鼠其胸腺重量多在67mg～77mg之间，ICR为国际通用对标准小鼠品系的称呼。(实验小鼠的品系之一)本发明中所述的给药注射时间为每天一次，每次0.2ml/只，连续给药3天，在给药后第4天处死称重。因为给药5天的实验结果数据差异较大，故选择给药3天。
本发明中所述的雷公藤多苷采用一种或多种助溶剂加热溶解，再用生理盐水稀释至无颗粒物质沉淀即可；氢化可的松用生理盐水稀释至所需浓度。由于高浓度的氢化可的松药液在低温下容易产生析晶现象，过高浓度的氢化可的松不利于腹腔注射(20mg/ml的有析晶现象产生)。本发明中采用吐温-80作为助溶剂。
本发明中所述的注射采用腹腔注射方式。因为腹腔注射较皮下肌肉注射反应更明显，而尾静脉注射操作难度大，技术要求较高，普通人员不容易掌握，故选择腹腔注射的方式进行。
本发明首次将小白鼠胸腺萎缩检测应用在中药领域测定雷公藤多苷的生物效价，通过对小白鼠腹腔注射雷公藤多苷或氢化可的松，使小鼠胸腺萎缩，剖取胸腺并称重，计算比较胸腺指数，确定雷公藤多苷相对于氢化可的松的效价比和不同雷公藤多苷之间的效价比，以此来控制雷公藤多苷的毒性，做到低毒高效。此外，本发明还可以用在雷公藤制剂和其内含成分(主要二萜类、三萜类)或单体(雷公藤甲素、生物碱、氯内酯甲等等)及具有免疫抑制作用的其它中药类(主要内含二萜类成分)，测定相应生物效价。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明。
具体实施方式(1).正常小鼠胸腺的重量取留仔数为8只/窝出生为18日龄，19日龄、20日龄、21日龄的ICR清洁级健康小鼠，称重，解剖取其胸腺称重。由表一可见，幼鼠体重及胸腺重量都是随着日龄的增加而增加，并且18日龄、19日龄及20日龄时幼鼠胸腺指数趋向平衡，故本发明选择日龄为18～20、体重为11g～13g、胸腺为67mg～77mg的幼鼠作为雷公藤多苷效价实验的标准动物，以胸腺指数作为反应指标，胸腺指数＝[胸腺(mg)/100g体重]的平方根。
表一 正常ICR小鼠胸腺参数表 (2).雷公藤多苷剂量范围的摸索取出生为18～20日龄，体重为11～13g的ICR小鼠75只，雌雄不计。按体重将其随机分成五组(雷公藤多苷125mg/kg，100mg/kg，80mg/kg，64mg/kg，51.2mg/kg)，15只一组，连续给药3天，在给药后第四天，称重，将小鼠断颈处死，解剖取其胸腺称重，计算。表二表明和胸腺指数呈线性关系的雷公藤剂量范围在64mg/kg～125mg/kg。
表二 雷公藤多苷注射剂量与胸腺指数对照表
(3).氢化可的松剂量范围的摸索取出生为18～20日龄，体重为11～13g的ICR幼鼠75只，雌雄不记。按体重将其随机分成5组(氢化可的松40mg/kg，32mg/kg，20.5kg/mg，16.4mg/kg)，15只/组。连续给药3天，在给药后第四天，称重，将小鼠断颈处死，解剖取其胸腺，计算。表三表明和胸腺指数呈线性关系的氢化可的松剂量范围在16.4mg/kg～40mg/kg。
表三 氢化可的松注射剂量与胸腺指数对照表
(4).市购雷公藤多苷(批号2001001)与氢化可的松的对比实验取出生为18～20日龄，体重为11～13g的ICR幼鼠60只，雌雄不计，按体重将其随机分成4组，15只/组)，氢化可的松2组高剂量(20mg/kg)，低剂量(16mg/kg)；雷公藤多苷2组高剂量(80mg/kg)，低剂量(64mg/kg)。连续给药3天，给药后第四天，称重，将小鼠断颈处死，解剖取其胸腺，计算胸腺指数。R值按量反应平行线简算法计算，表四计算得R＝0.130，即雷公藤多苷效价是氢化可的松的0.130倍。
表四 雷公藤多苷小鼠重量法实验结果
(5).本单位生产的雷公藤多苷(批号001121)与氢化可的松的对比实验取出生为18-20日龄，体重为11-13g的ICR幼鼠60只，雌雄不计。按体重将其随机分成4组，15只/组，氢化可的松2组高剂量(21mg/kg)，低剂量(14.7mg/kg)；雷公藤多苷2组高剂量(120mg/kg)，低剂量(84mg/kg)。连续给药3天，给药后第四天，称重，将小鼠断颈处死，解剖取其胸腺，计算胸腺指数。R值同样按量反应平行线简算法计算，由表五计算得R＝1.525，即本单位生产的雷公藤多苷效价是氢化可的松的1.525倍。
表五 本单位生产的雷公藤多苷小鼠重量法实验结果
上述(2)～(5)操作步骤中的雷公藤多苷采用吐温-80加热溶解，再用生理盐水稀释至无颗粒物质沉淀即可；氢化可的松用生理盐水稀释至所需浓度采用腹腔注射给药，注射时间为每天一次，每次0.2ml/只，连续给药3天，在给药后第4天处死称重。
单次给药量0.2ml是根据小鼠的体重与所确定的剂量mg/kg及所配置的药物浓度而定，实验中小鼠体重按其平均体重20g。
如 事先按照给药0.2ml/只配好所需的药物浓度即可。
权利要求
1.一种测定雷公藤多苷效价的方法，其特征是首先对一批次的多组小白鼠分别进行氢化可的松和雷公藤多苷的注射，寻求导致小白鼠胸腺萎缩呈线性关系的剂量范围；接着在该剂量范围对同一批次的多组小白鼠分别进行氢化可的松和雷公藤多苷的注射，连续数天给药后，称重，将小白鼠断颈处死，剖取胸腺称重，计算比较两者的胸腺指数。
2.根据权利要求1所述的测定雷公藤多苷效价的方法，其特征是所述的实验小白鼠随机分成四或六组，其中二分之一组注射氢化可的松，剂量范围为16.4mg/kg～40mg/kg；另二分之一组注射雷公藤多苷，剂量范围为64mg/kg～125mg/kg。
3.根据权利要求1或2所述的测定雷公藤多苷效价的方法，其特征是所述的小白鼠为出生18～20日龄，体重11～13g，胸腺为67mg～77mg的ICR幼鼠。
4.根据权利要求1或2所述的测定雷公藤多苷效价的方法，其特征是所述的给药注射时间为每天一次，连续给药3天，在给药后第4天处死。
5.根据权利要求3所述的测定雷公藤多苷效价的方法，其特征是所述的给药注射时间为每天一次，连续给药3天，在给药后第4天处死。
6.根据权利要求1所述的测定雷公藤多苷效价的方法，其特征是所述的雷公藤多苷采用一种或多种助溶剂加热溶解，再用生理盐水稀释至无颗粒物质沉淀即可；氢化可的松用生理盐水稀释至所需浓度。
7.根据权利要求1所述的测定雷公藤多苷效价的方法，其特征是所述的注射采用腹腔注射方式。
全文摘要
本发明用于测定雷公藤多苷的免疫控制效价，特别是一种测定雷公藤多苷效价的方法。雷公藤多苷成分复杂，毒性大。生产厂家通常用LD50法来控制毒性。但毒性相同的两批雷公藤多苷产品效价有很大的区别，仅靠LD50测定法不能测定雷公藤多苷的效价，无法确保产品低毒高效。本发明公开了一种测定方法，其特征是先对一批次的多组小白鼠分别进行氢化可的松和雷公藤多苷的注射，寻求导致小白鼠胸腺萎缩呈线性关系的剂量范围；接着在该剂量范围对同一批次的多组小白鼠分别进行氢化可的松和雷公藤多苷的注射，连续数天给药后，称重，将小白鼠断颈处死，剖取胸腺称重，计算比较两者胸腺指数，将生物效价法和LD50法结合起来控制雷公藤多苷的质量。
文档编号G01N33/48GK1727894SQ20041005335
公开日2006年2月1日 申请日期2004年7月28日 优先权日2004年7月28日
发明者金春晖, 吴锦权, 章美英, 朱承伟 申请人:浙江得恩德制药有限公司