专利名称：一种抗真菌剂筛选试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种可用于筛选抗真菌剂的试剂盒，并可研究抗真菌机制及对人体毒性。
背景技术：
在过去的近100年中，抗真菌药物研究取得了骄人成绩，但临床抗真菌药的选择范围仍很窄，种类很少，因此寻找新的抗真菌剂，研究抗真菌作用机制就成为当务之急。
麦角甾醇是真菌细胞膜上含有的一种特殊生物成分，对于维持真菌细胞膜稳定性和流动性发挥重要作用，现有的抗真菌剂多针对麦角甾醇的生物合成通路，从而影响了麦角甾醇的生物合成，发挥抗真菌作用。其中多烯类抗真菌药物主要通过与真菌细胞膜麦角甾醇的直接结合，使真菌细胞膜形成空洞，内容物外泄而死亡；人体细胞的细胞膜虽不含麦角甾醇，但含有大量胆固醇，某些抗真菌剂也能与胆固醇直接结合，如多烯类药物与胆固醇可直接结合，所以当用多烯类药物抗真菌感染同时，对人体细胞也可能产生毒性，只是毒性大小不同而已。由于这种特殊的作用机制，多烯类药物抗真菌作用强，不易产生耐药性，在临床占有重要地位，是抗真菌药物的“金标准”，因此筛选类似作用机制的抗真菌药物成为一个重要研究方向。
抗真菌剂筛选的常规方法有微量液基稀释法、试管法、纸片法等，是通过真菌在含药培养基中的生长情况进行判断，但只能对抗真菌作用进行初步筛选，对于其作用机制及对人体是否有毒性等重要内容难以确定，还需大量的其他实验加以证实。为此建立一种方法，筛选直接结合麦角甾醇的抗真菌剂，同时确定其对人体的毒性就非常重要。
发明内容
本发明根据真菌细胞膜含麦角甾醇而不含胆固醇，人体细胞含胆固醇而不含麦角甾醇的差异，提供一种快速有效筛选抗真菌化合物的试剂盒，根据本试剂盒的检测结果，来判断该受试物有无抗真菌作用，是否通过与麦角甾醇直接结合产生抗真菌作用，以及会不会与胆固醇结合造成对人体的毒性，从而决定取舍。
本发明试剂盒由盒体及装在盒体内的药敏板和试剂A、B、C、D、E、F各一管组成1.药敏板多孔板一块，经钴60照射灭菌；2.试剂A1摩尔/升NaOH溶液5ml；3.试剂B蛋白胨10克，葡萄糖40克，琼脂18克(临用时加三蒸水900毫升溶解，用试剂A调整pH至7.0，定容至1000毫升，高压灭菌后制成斜面，4℃保存)；4.试剂C酵母浸膏10克，蛋白胨20克，葡萄糖20克(临用时加三蒸水900毫升溶解，定容至1000毫升，高压灭菌后4℃保存)；5.试剂DRPMI 1640 8.0克，碳酸氢钠2.0克，吗啡啉丙磺酸34.5克[临用时加三蒸水900毫升溶解，用试剂A调pH至7.0(25℃)，定容至1000毫升，滤过消毒，4℃保存]；6.试剂E含34.63微摩尔/升麦角甾醇的DMSO溶液5ml(临用时，加入上述试剂D溶液1000毫升，滤过消毒，4℃保存)；7.试剂F含34.63微摩尔/升胆固醇的DMSO溶液5ml(临用时，加入上述试剂D溶液1000毫升，滤过消毒，4℃保存)。
RPMI 1640为美国Gibco公司产品，麦角甾醇、胆固醇为美国Sigma公司产品，其余试剂为国产分析纯。
本发明试剂盒使用方法如下1.制备受试物溶液受试物用二甲基亚砜(DMSO)配成所需浓度，倍比稀释为5～20个浓度梯度的溶液，4℃保存备用。
2.将试剂盒中各管试剂配制成如上括号内相应的斜面和溶液。
3.活化真菌用接种圈从真菌保存管中挑取少量真菌，划线接种于试剂B斜面上，35℃培养24小时～48小时。再用接种圈从试剂B斜面上的菌落挑取真菌少量，接种至1毫升试剂C中，于37℃、250转/分钟振荡培养，活化16小时，使真菌处于指数生长后期。
4.制备真菌菌液将上述活化真菌，用血细胞计数板计数，分别以试剂D调整菌液浓度至(1～5)×105个/毫升，制成试剂D菌液；用试剂E稀释为(1～5)×105个/毫升浓度的菌液，配成含麦角甾醇的试剂E菌液；用试剂F稀释为(1～5)×105个/毫升浓度的菌液，配成含胆固醇的试剂F菌液。
5.测定最低抑菌浓度值(MIC80值)取无菌药敏板，1号孔作空白对照，加1微升DMSO及99微升试剂D；第2～11号孔加入倍比稀释的受试物溶液1微升及99微升试剂D菌液；第12号孔不含受试物，加1微升DMSO及99微升试剂D菌液作阳性对照；试剂E菌液和试剂F菌液按上述试剂D菌液同法操作，放在同一块灭菌药敏板上，各平行操作2次。
将该药敏板于25～37℃培养12～168小时后，用酶标分析仪于620纳米测各孔光密度值，各与相应的阳性对照孔比，以光密度值下降80％以上的最低浓度孔中的受试物浓度为MIC80，(真菌生长80％被抑制的受试物浓度)。
以试剂D测得的MIC80值作为参考值，试剂E、试剂F测得的MIC80值与参考值进行比较，对结果进行判断1.试剂D测得的参考值≥64mg·L-1，表明受试物没有抗真菌作用，不用比较试剂E、试剂F测得的的结果；2.试剂D测得的参考值＜64mg·L-1，试剂E结果＞参考值，试剂F结果＞参考值，表明受试物有抗真菌作用，并说明其与麦角甾醇直接结合发挥抗真菌作用，该受试物可与胆固醇结合而对人体有毒性；3.试剂D测得的参考值＜64mg·L-1，试剂E结果＞参考值，试剂F结果≤参考值，表明受试物有抗真菌作用，其与麦角甾醇直接结合发挥抗真菌作用，该受试物难与胆固醇结合而对人体毒性小，因此可以作为抗真菌剂；4.试剂D测得的参考值＜64mg·L-1，试剂E结果≤参考值，试剂F结果＞参考值，表明受试物有抗真菌作用，其作用机制尚需进一步研究，该受试物可与胆固醇结合对人体有毒性；5.试剂D测得的参考值＜64mg·L-1，试剂E结果≤参考值，试剂F结果≤参考值，表明受试物有抗真菌作用，作用机制及毒性都需进一步研究。
本试剂盒可用于筛选不同来源的受试物，包括天然产物、化学合成产物、微生物发酵产物、海洋提取物等。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，对本发明作详细描述。
实施例1用本发明试剂盒检测两性霉素B的抗真菌作用一.配制溶液1.受试物两性霉素B用二甲基亚砜(DMSO)配成6.4毫克/毫升浓度，并倍比稀释成3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625毫克/毫升10个浓度梯度的溶液，4℃保存备用。
2.试剂A1摩尔/升Na0H溶液5ml；3.试剂B蛋白胨10克，葡萄糖40克，琼脂18克，加三蒸水900ml溶解，用试剂A调整pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后制成斜面，4℃保存；4.试剂C酵母浸膏10克，蛋白胨20克，葡萄糖20克，加三蒸水900ml溶解，定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存；5.试剂DRPMI 1640 8.0克，碳酸氢钠2.0克，吗啡啉丙磺酸34.5克，加三蒸水900ml溶解，用试剂A调pH至7.0(25℃)，定容至1000ml，滤过消毒，4℃保存；6.试剂E含34.63微摩尔/升麦角甾醇的DMSO溶液5ml，加入上述试剂D溶液1 000毫升，滤过消毒，4℃保存；7.试剂F含34.63微摩尔/升胆固醇的DMSO溶液5ml，加入上述试剂D溶液1000毫升，滤过消毒，4℃保存。
二.测定两性霉素B最低抑菌浓度值(MIC80值)接种圈从白色念珠菌保存管中挑取少量白色念珠菌，划线接种于试剂B斜面上，35℃培养24小时。再用接种圈从试剂B斜面上挑取真菌少量，接种至1毫升试剂C，于37℃、250转/分钟振荡培养，活化16小时，使真菌处于指数生长后期。
将活化真菌用血细胞计数板计数，分别以试剂D调整菌液浓度至3×105个/毫升，制成试剂D菌液；用试剂E稀释为3×105个/毫升浓度的菌液，配成含麦角甾醇的试剂E菌液；用试剂F稀释为3×105个/毫升浓度的菌液，配成含胆固醇的试剂F菌液。
无菌96孔板，1号孔作空白对照，加1微升DMSO及99微升试剂D；第2～11号孔加入倍比稀释的受试物溶液1微升及99微升试剂D菌液；第12号孔不含受试物，加1微升DMSO及99微升试剂D菌液作阳性对照，平行操作2次。试剂E菌液和试剂F菌液在同一块药敏板上，按同法操作。
将药敏板于35℃培养24小时后，用酶标分析仪于620纳米测各孔光密度值。试剂D测得的两性霉素B对白色念珠菌MIC80值为0.25微克/毫升，提示两性霉素B具有较强的抗白色念珠菌活性，以此作为参考值；试剂E测得的MIC80值为16微克/毫升，明显大于上述MIC80参考值，表明两性霉素B通过与麦角甾醇结合而发挥抗真菌作用；试剂F测得的MIC80值为1微克/毫升，略大于上述MIC80参考值，表明两性霉素B亦可与胆固醇结合，对人体有一定毒性。
实施例2用本发明试剂盒检测TTS-12的抗真菌作用一.配制溶液1.受试物TTS-12为蒺藜中提取的皂苷类天然产物，由第二军医大学药学院植物化学教研室提供，用二甲基亚砜(DMSO)配成6.4毫克/毫升浓度，并倍比稀释成6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125毫克/毫升10个浓度梯度的溶液，4℃保存备用。
2.试剂A0.5摩尔/升NaOH溶液5ml；3.试剂B蛋白胨10克，葡萄糖40克，琼脂18克，配法同实施例1；4.试剂C酵母浸膏10克，蛋白胨20克，葡萄糖20克，配法同实施例1；5.试剂DRPMI 1640 8.0克，碳酸氢钠2.0克，吗啡啉丙磺酸34.5克，配法同实施例1；6.试剂E含34.63微摩尔/升麦角甾醇的DMSO溶液5ml，配法同实施例1；7.试剂F含34.63微摩尔/升胆固醇的DMSO溶液5ml，配法同实施例1。
二.测定TTS-12最低抑菌浓度值(MIC80值)接种圈从白色念珠菌保存管中挑取少量白色念珠菌，划线接种于试剂B斜面上，35℃培养48小时。再用接种圈从试剂B斜面上挑取真菌少量，接种至1毫升试剂C，于37℃、250转/分钟振荡培养，活化16小时，使真菌处于指数生长后期。
将活化真菌用血细胞计数板计数，分别以试剂D调整菌液浓度至2×105个/毫升，制成试剂D菌液；用试剂E稀释为2×105个/毫升浓度的菌液，配成含麦角甾醇的试剂E菌液；用试剂F稀释为2×105个/毫升浓度的菌液，配成含胆固醇的试剂F菌液。
无菌48孔板，1号孔作空白对照，加1微升DMSO及99微升试剂D；第2～11号孔加入倍比稀释的受试物溶液1微升及99微升试剂D菌液；第12号孔不含受试物，加1微升DMSO及99微升试剂D菌液作阳性对照，试剂E菌液和试剂F菌液在同一块药敏板上按同法操作，平行操作2次。
再将药敏板于25℃培养24小时后，用酶标分析仪于620纳米测各孔光密度值。试剂D测得的TTS-12对白色念珠菌MIC80值为2微克/毫升，提示TTS-12具有较强的抗白色念珠菌活性，以此值作为参考值；试剂E测得的MIC80值为16微克/毫升，大于参考值，表明TTS-12能与麦角甾醇结合，发挥抗真菌作用；试剂F测得的MIC80值为2微克/毫升，等于参考值，表明TTS-12难与胆固醇结合，对人体毒性较小。
实施例3用本发明试剂盒检测Philinopside A(I)的抗真菌作用一.配制溶液1.受试物Philinopside A(I)为从海洋生物条纹拟海牛中分得的羊毛甾烷型三萜皂苷类化合物，纯度＞95％，经鉴定为16β-乙酰氧基-3-O-[3-O-β-D-甲基吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃木糖-(1→4)-β-D-吡喃奎诺糖-(1→2)-4-O-磺酸钠-β-D-吡喃木糖]-海参烷-7，24-二烯-3β-醇，命名为Philinopside A(I)，由第二军医大学药学院海洋药物研究中心提供，用二甲基亚砜(DMSO)配成25.6毫克/毫升浓度，并倍比稀释成25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05毫克/毫升10个浓度梯度的溶液，4℃保存备用。
2.试剂A0.5摩尔/升NaOH溶液5ml；3.试剂B蛋白胨10克，葡萄糖40克，琼脂18克，配法同实施例1；4.试剂C酵母浸膏10克，蛋白胨20克，葡萄糖20克，配法同实施例1；5.试剂DRPMI 1640 8.0克，碳酸氢钠2.0克，吗啡啉丙磺酸34.5克，配法同实施例1；6.试剂E含34.63微摩尔/升麦角甾醇的DMSO溶液5ml，配法同实施例1；7.试剂F含34.63微摩尔/升胆固醇的DMSO溶液5ml，配法同实施例1。
二.测定Philinopside A(I)最低抑菌浓度值(MIC80值)接种圈从白色念珠菌保存管中挑取少量白色念珠菌，划线接种于试剂B斜面上，35℃培养24小时。再用接种圈从试剂B斜面上挑取真菌少量，接种至1毫升试剂C，于37℃、250转/分钟振荡培养，活化16小时，使真菌处于指数生长后期。
将活化真菌用血细胞计数板计数，分别以试剂D调整菌液浓度至2×105个/毫升，制成试剂D菌液；用试剂E稀释为3.2×105个/毫升浓度的菌液，配成含麦角甾醇的试剂E菌液；用试剂F稀释为3.2×105个/毫升浓度的菌液，配成含胆固醇的试剂F菌液。
无菌96孔板，1号孔作空白对照，加1微升DMSO及99微升试剂D；第2～11号孔加入倍比稀释的受试物溶液1微升及99微升试剂D菌液；第12号孔不含受试物，加1微升DMSO及99微升试剂D菌液作阳性对照，试剂E菌液和试剂F菌液在同一块药敏板上按同法操作，平行操作2次。
再将药敏板于37℃培养168小时后，用酶标分析仪于620纳米测各孔光密度值。试剂D测得的Philinopside A(I)对白色念珠菌MIC80值为16微克/毫升，提示Philinopside A(I)具有抗白色念珠菌活性，以此值作为参考值；试剂E测得的MIC80值为64微克/毫升，大于参考值，表明TTS-12能与麦角甾醇结合，发挥抗真菌作用；试剂F测得的MIC80值为32微克/毫升，大于参考值，表明TTS-12与胆固醇有一定结合，对人体有毒性。
以上实验表明，本发明试剂盒可用于筛选不同来源的受试物，包括天然产物、化学合成产物、微生物发酵产物、海洋提取物等，本试剂盒成本低廉，操作简便，可快捷有效筛选抗真菌剂。
权利要求
1.一种抗真菌剂筛选试剂盒，包括盒体与试剂，其特征在于还包括药敏板一块，所说的试剂包括试剂A、B、C、D、E、F各一管试剂A1摩尔/升NaOH溶液5ml；试剂B蛋白胨10克，葡萄糖40克，琼脂18克；试剂C酵母浸膏10克，蛋白胨20克，葡萄糖20克；试剂DRPMI 1640 8.0克，碳酸氢钠2.0克，吗啡啉丙磺酸34.5克(0.165摩尔/升)；试剂E含34.63微摩尔/升麦角甾醇的DMSO溶液5ml；试剂F含34.63微摩尔/升胆固醇的DMSO溶液5ml。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是一种可用于筛选抗真菌剂，并可研究抗真菌机制及对人体毒性的试剂盒，其组成包括药敏板一块和试剂，根据本试剂盒检测结果，由该受试物是否具有抗真菌作用，能否与麦角甾醇和胆固醇结合以及结合的状况，来判断该受试物能否作为抗真菌剂，及抗真菌的作用机制和是否对人体有毒性。本试剂盒成本低廉，操作简便，可快捷有效筛选抗真菌剂，并可同时研究作用机制及对人体的毒性。
文档编号G01N21/31GK1588067SQ200410052988
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月20日 优先权日2004年7月20日
发明者张军东, 姜远英, 曹永兵, 徐铮, 高平挥, 阎澜 申请人:中国人民解放军第二军医大学