专利名称：雷公藤甲素顺铂联合运用在制备抗耐药性胰腺癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及雷公藤甲素顺钼联合运用在制备抗耐药性胰腺癌药物以及在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用。
背景技术：
胰腺癌是一种常见的消化道肿瘤，具有恶性程度高、侵袭速度快和致死率高的特点。由于目前尚缺乏早期发现胰腺癌的有效手段，加之确诊后病情进展迅速，致使大多数胰腺癌病人无法实施手术。据世界卫生组织癌症研究中心的最新估计(GL0B0CAN 2008)，全球范围内每年新诊断胰腺癌病例27.87万例，死亡沈.27例，死亡发病比为0.94 [1]。在所有常见的恶性肿瘤中，胰腺癌患者的生存率最低，其平均中位生存期为3个月，5年生存率为 3-5%。参考文献[1]。[1] Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. GL0B0CAN 2008，Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10. http://www. iarc. fr/ en/publication/eresources/cancerbases/index, php嘧啶核苷类似物吉西他宾自上世纪末以来被认为是治疗胰腺癌的唯一有效的药物， 但也只有20-30%的病人对该药敏感，该药与其它一线抗癌药物联合运用未见协同作用 [2-4]。药物的耐受性的产生是导致胰腺癌化学治疗失败的最主要原因。针对药物耐受性发展新的化学治疗药物已经成为治疗胰腺癌的一个重要方向。参考文献[2-4]。[2] Ina S, Hirono S, Noda T, et al. Identifying molecular markers for chemosensitivity to gemcitabine in pancreatic cancer: increased expression of interferon-stimulated gene 15 kd is associated with intrinsic chemoresistance. Pancreas. 39(4): 473-485. [3] Rivera F, Lopez-Tarruella S, Vega-Villegas ME, et al. Treatment of advanced pancreatic cancer: from gemcitabine single agent to combinations and targeted therapy. Cancer Treat Rev. 2009. 35(4): 335-339. [4] Heinemann V. Gemcitabine: progress in the treatment of pancreatic cancer. Oncology. 2001. 60(1) : 8-18.雷公藤甲素是从卫矛科植物雷公藤rripterj^i wilfoudii Hook. f.左中分离得到的环氧化二萜内酯化合物。雷公藤用于治疗自身免疫性疾病如肾炎、类风湿关节炎等已经有几个世纪。近年来，越来越多研究发现，雷公藤甲素具有非常强的抗癌活性，通过促进肿瘤细胞凋亡显著抑制肿瘤的生长及转移。雷公藤甲素与多种抗癌药(如阿糖胞苷、阿霉素、 拓扑异构酶I抑制剂CPT-11)联合运用可增强这些药物的抗肿瘤效果，提示雷公藤甲素作为肿瘤增敏剂的应用潜力[5，6]。参考文献[5]和[6]。[5] Pigneux A, Mahon FX, Uhalde Μ, et al. TPL cooperates with chemotherapy to induce apoptosis in acute myeloid leukemia cells. Exp Hemato1. 2008. 36(12) : 1648—1659. [6] Chang WT, Kang JJ,Lee KY, et al. TPL and chemotherapy cooperate in tumor cell apoptosis. A role for the p53 pathway. J Biol Chem. 2001. 276(3) : 2221-2227.顺钼属于高效广谱抗癌药，主要通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长。其对胰腺癌治疗不敏感，与吉西他宾联合运用也达不到理想的治疗作用[7]。参考文献[7]。[7] Choi JH, Oh SY, Kwon HC, et al. Gemcitabine versus gemcitabine combined with DDP treatment locally advanced or metastatic pancreatic cancer: a retrospective analysis. Cancer Res Treat. 2008. 40(1) : 22-26.HSP27，包括HSP79，HSP90均是热休克蛋白家家族HSI3s成员。HSI3s属于应激蛋白的一种。作为小分子伴娘蛋白，HP^参与细胞凋亡过程与癌变过程。大量的文献报道 HSP27在药物耐受的肿瘤，比如胃癌、结肠癌、卵巢癌和淋巴癌中高度表达，在药物耐受中扮演了非常重要的作用。在侵袭性恶性胰腺癌细胞株和雄性激素不敏感的细胞株，HSP27 表达显著上调。HSP27可能是一个潜在的针对药物耐受性的靶点[8]。参考文献[8]。 [8] Cornford PA, Dodson AR, Parsons KF, et al. Heat shock protein expression independently predicts clinical outcome in prostate cancer. Cancer Res. 2000. 60(24) : 7099-7105.我们的研究发现，与单独运用雷公藤甲素和与顺钼相比，雷公藤甲素与顺钼联合运用可协同增强对耐药性胰腺癌PANC-I和MIA I^Ca-2细胞的诱导凋亡作用。裸鼠异位移植肿瘤试验表明，雷公藤甲素与顺钼联合运用显著增强了抑癌活性。据我们的文献检索，至今未见关于雷公藤甲素和与顺钼联合运用协同增强抗癌或抑瘤效果的报道
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种药物组合物，该组合物由雷公藤甲素与顺钼组成。
本发明的另一目的是提供上述组合物在制备抗耐药性胰腺癌药物中的应用。
本发明的进一步目的是提供上述组合物在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案我们的研究表明，在耐药性胰腺癌细胞株PANC-I和MIA PaCa-2中，单独运用较低剂量的雷公藤甲素或顺钼仅轻微降低细胞生存率，而两者联合使生存率降低了大约50% 以上。同时，通过两者多个浓度联合应用测定得到的联合治疗系数CI低于1，表明两种药物可协同杀伤胰腺癌细胞，其协同抑瘤作用是通过线粒性途径实现的。雷公藤甲素和顺钼重量份数比为1 一20:2—120。雷公藤甲素-顺钼协同抑癌作用可能与HSP27显著下调紧密相关。此外，浓缩、碎裂的细胞核象以及凋亡执行酶caspase-3活性的3. 3倍增强，进一步提示两种药物联合应用诱导了明显的细胞凋亡，且较单独应用效果明显。
雷公藤甲素-顺钼联合运用，较单独使用雷公藤甲素或顺钼，PANC-I细胞浆中细胞色素C的含量及Caspase-9活性显著增加，表明雷公藤甲素_顺钼协同诱导凋亡作用是通过线粒途径介导的。
与单独应用雷公藤甲素或顺钼相比较，两者联合应用可协同使HSP27下调表达。 沉默HSP27基因，可使PANC-I细胞对雷公藤甲素或顺钼的敏感性提高，生存率较单用化疗药物明显降低。这些提示HSP27下调可增强药物的抗癌效果，可能与雷公藤甲素和顺钼联合运用增强化学治疗敏感性相关。
在裸鼠异种移植模型上，联合运用低剂量的雷公藤甲素(0.25 mg/kg，l次/2天) 和顺钼(3mg/kg，1次/1周)显著抑制肿瘤的生长，而单用雷公藤甲素或顺钼均不能引起肿瘤的生长抑制。对各组的肿瘤切片的免疫组化结果表明，两种药物联用显著下调HSP27的蛋白表达，与细胞株上的结果一致。这说明雷公藤甲素和顺钼联合运用能作为抗肿瘤药物的增敏剂。
综上，雷公藤甲素-顺钼联合运用对耐药性胰腺癌具有明显的协同抑制作用。到目前为止，还没有关于雷公藤甲素-顺钼联合运用具有协同抑制胰腺癌的研究报导。
图1为雷公藤甲素增强了顺钼对吉西他宾耐受的胰腺癌细胞株PANC-I凋亡的诱导作用。
A雷公藤甲素对细胞存活率的影响；B Hoechst 33258染色箭头指的是凋亡细胞的细胞核；C caspase-3的活性；D乳酸脱氢酶(LDH)的相对释放量。数值用平均值士标准差(n=3)。PANC-I经雷公藤甲素(25 nM)和(或)顺钼(16 μ M)共孵48小时；TPL—雷公藤甲素；DDP—顺钼；IPL+DDP —雷公藤甲素与顺钼联合运用；与对照组比较，* p< 0.05,** /7 < 0. 01。
图2为雷公藤甲素增强了顺钼对吉西他宾耐受的胰腺癌细胞株MIA PaCa-2凋亡的诱导作用。
A雷公藤甲素对细胞存活率的影响；B Hoechst 33258染色箭头指的是凋亡细胞的细胞核；C caspase-3的活性；D乳酸脱氢酶(LDH)的相对释放量。数值用平均值士标准差(n=3)。MIA PaCa-2经雷公藤甲素05 nM)和(或)顺钼(16 μ M)共孵48小时; TPL—雷公藤甲素；DDP—顺钼；TPL+DDP —雷公藤甲素与顺钼联合运用；与对照组比较，* ρ< 0. 05，^ ρ < 0. 01。
图3为雷公藤甲素和顺钼诱导凋亡的协同作用经线粒体途径介导。
A Cytochrome c 的相对释放；B caspase-9 活性。PANC-1 经雷公藤甲素(25 nM) 和(或)顺钼(16 μ Μ)共孵48小时；TPL—雷公藤甲素；DDP—顺钼；TPL+DDP —雷公藤甲素与顺钼联合运用；与对照组比较，^ ρ < 0. 01。
图4为雷公藤甲素与顺钼联合运用下调了 PANC-I细胞中HSP27的蛋白表达。
A雷公藤甲素对HSP27、HSP70、HSP90蛋白水平的影响；B顺钼对HSP27、HSP70、 HSP90蛋白水平的影响；C雷公藤甲素与顺钼联合运用对HSP27和HSP70蛋白水平的影响。 PANC-I经雷公藤甲素05 nM)和(或)顺钼(16 μ M)共孵48小时；TPL—雷公藤甲素； DDP—顺钼；TPL+DDP —雷公藤甲素与顺钼联合运用；与对照组比较，#或## ρ < 0.01。
图5为HSP27敲除增强了雷公藤甲素或顺钼对PANC-I细胞的杀伤作用。
A HSP27的沉默浓度为50 nM的siRNA片段01，02和03对PANC-1细胞干预48小时的沉默效用检测；B沉默HSP27对雷公藤甲素杀伤肿瘤细胞的增敏作用；C沉默HSP27对顺钼杀伤肿瘤细胞的增敏作用。ρ < 0.05为阴性对照寡核苷酸联合雷公藤甲素和HSP27-siRNA联合雷公藤甲素组相比；ρ < 0. 01为阴性对照寡核苷酸联合顺钼和HSP27-siRNA联合顺钼组相比.图6为雷公藤甲素和顺钼联合运用显著地抑制了肿瘤的生长。
A药物治疗对裸鼠异体移植肿瘤的生长的影响=PANC-I细胞(5X IO6)被接种到6 周龄裸鼠的侧腹。10天后，成功接种了肿瘤的裸鼠被分成四组，分别给予含1% DMSO的生理盐水(1次/2天)、雷公藤甲素0.25 mg/kg (1次/2天)、顺钼;3mg/kg (1次/1周)以及联合给予雷公藤甲素和顺钼。/7 < 0.01，与溶剂组比较；B第25天动物的肿瘤重量；C肿瘤的形态大小；D裸鼠的体重变化；E经免疫组化方法测定的HSP27蛋白水平。Vehicle—溶剂组；TP—雷公藤甲素组；DDP—顺钼组；TPL+DDP—雷公藤甲素与顺钼联合运用组。
具体实施方式
实施例1 雷公藤甲素增强顺钼对吉西他宾耐受的胰腺癌细胞株PANC-I凋亡的诱导作用1)细胞存活率的测定肿瘤细胞用含10% (v/v) FBS的DMEM培养基稀释并接种至96孔板。使细胞浓度为 2Χ103/孔，37°C、5%C02孵育过夜。遂加入药物，孵育48小时。然后每孔加入20 ul MTT溶液，继续培养4 h。IOOOrpm离心lOmin，小心吸掉上清，每孔加入100 ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪于570nm (630nm校准)处测量各孔的吸光值0D。
细胞存活率=0Dt/0D。X100% ODt，试验组OD值；0D。，对照组OD值。
2) caspase-3 活性测定将肿瘤细胞OXlO6/孔)接种至6孔板，培养过夜使贴壁。加入药物，孵育48小时。冰浴下加入裂解液裂解15 min，4°C 15000rpm离心10 min，吸取上清液用Lowry法测定上清蛋白含量。加入反应缓冲液和caspase-3底物，培养4小时，用酶标仪测定405 nm 处的OD值。用蛋白量对caspase-3活性进行标准化，结果表示为与对照组的相对比值。
3) Hoechst 33342 染色肿瘤细胞中加入Hoechst 33342，避光培养20min，用PBS洗涤2-3次，于340 nm在荧光显微镜下观察。
4) LDH释放量检测将肿瘤细胞OXlO6/孔)接种至6孔板，培养过夜使贴壁。加入药物，孵育48小时。 每孔吸取50 μ 1培养基上清于另一 96孔板，每孔加入反应液50 μ 1，置37°C 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养30 min.然后加入50 μ 终止液，在酶标仪上用波长450 nm测定各孔的OD值。结果表示为与对照组的相对比值。
在吉西他宾耐受的胰腺癌细胞株PANC-I中，单独运用雷公藤甲素(TPL，25 nM)或顺钼(DDP，16 μ Μ)仅略微降低了 PANC-I细胞的存活率，而两种药物联合运用(TPL+DDP) 则显著地降低了细胞存活率(与对照组比较，降低了讨％)。联合治疗系数CI低于1，揭示两种药物联合运用为协同作用。细胞经Hoechst 33342染色后进行形态学观察，与其它组相比，联合用药组细胞核出现明显浓缩和碎裂。药物联合运用组，在细胞凋亡中起着重要作用的caspase-3的活性较对照组相比，增强了 3. 3倍。相比之下，雷公藤甲素组仅增强了 1. 46倍，顺钼为1.87倍。各组LDH释放与对照组相比均未见明显改变。结果如图1所示。
实施例2 雷公藤甲素增强顺钼对吉西他宾耐受的胰腺癌细胞MIA I^aCa-2凋亡的诱导作用细胞存活率、caspase-3活性、Hoechst 33342染色及LDH释放同实施例1。
在吉西他宾耐受的胰腺癌细胞MIA I^aCaj中，单独运用雷公藤甲素(TPL，25 nM) 或顺钼(DDP，16 μ Μ)仅略微降低了细胞存活率，而两种药物联合运用(TPL+DDP)则显著地降低了细胞存活率(与对照组比较，降低了 59 %)。联合治疗系数CI低于1，揭示两种药物联合运用为协同作用。细胞经Hoechst 33342染色后进行形态学观察，与其它组相比， 联合用药组细胞核出现明显浓缩和碎裂。药物联合运用组，在细胞凋亡中起着重要作用的 caspase-3的活性较对照组增强了 2. 6倍。相比之下，雷公藤甲素组仅增强了 1. 25倍，顺钼为1.65倍。各组LDH释放与对照组相比均未见明显改变。结果如图2所示。
实施例3雷公藤甲素-顺钼协同诱导凋亡作用通过线粒途径介导 1)细胞色素C测定将肿瘤细胞G2X IO6/孔)接种至6孔板，培养过夜使贴壁。加入药物，孵育48小时。 抽提各组的胞浆蛋白，再将实验各组的胞浆蛋白液及梯度稀释后的细胞色素C标准液加入 96孔酶标板，每孔100 μ 过夜。每个样品加3个孔，以鉴定区别阳性结果与污染所致的假阳性结果。次日，将96孔板中的培养液吸出，按EL I SA试剂盒步骤进行操作用洗液(w ash solution)洗 1 次，加入分析液(assay diluent)，每孔 200 μ 1 室温 lh。 加入用分析液稀释的(1:350)鼠抗马细胞色素C抗体，室温下摇3 h。用洗液洗3次后，加入用分析液稀释的(1:1000) HRP标记的抗人IgG的二抗，室温下摇lh。洗8次后加入感光剂，30m in后终止反应，于酶标仪450nm下读数。用蛋白量对caspase-3活性进行标准化，结果表示为与对照组的相对比值。结果如图3A所示。
2) caspase-9 活性测定用Caspase-GloTM发光实验进行测定。细胞((2X IO5/孔)被同时接种在透明和不透明的96孔板中，培养过夜使贴壁。加入100 μ 1 Caspase-Glo反应液，轻轻振摇使混勻， 室温下孵育1.5小时后测定萤光。透明96孔板用MMT法测定细胞存活率。用细胞数对 caspase-9活性进行标准化，结果表示为与对照组的相对比值。
在PANC-I细胞中，雷公藤甲素-顺钼联合运用显著增强了细胞色素C从线粒体释放进入胞液的量，与对照组相比，细胞色素C的含量升高了约3倍。雷公藤甲素-顺钼联合运用，Caspase-9活性与对照组相比增加了约9倍。均较单独使用雷公藤甲素或顺钼有显著升高。提示，雷公藤甲素-顺钼协同抑瘤作用是通过线粒途径介导的。结果如图:3B所示。
实施例4雷公藤甲素与顺钼联合运用下调了 PANC-I细胞中HSP27的蛋白表达 Western blotting参照Qiu等报道[9]的方法进行。如图4所示，雷公藤甲素单独应用在25nM至IOOnM浓度范围内可剂量依赖性的降低HSP27的蛋白表达，IOOnM可下调HSP70 的表达，对HSP90无影响；顺钼单独运用对HSP70和HSP90的蛋白表达没有影响，但能剂量依赖性的下调HSP27的蛋白表达。随雷公藤甲素和顺钼浓度的增加，HSP27蛋白表达呈浓度依赖地下调。将25nM雷公藤甲素与16 μ M的顺钼联合运用，HSP27下调到一个相当低的水平。HSP27可通过结合cytochrome c抑制凋亡，因此该蛋白的协同下调很可能是雷公藤甲素与顺钼联合运用协同诱导凋亡的重要机理。参考文献[9]。[9] Qiu D, Zhao G, Aoki Y,et al. Immunosuppressant PG490 (TPL) inhibits T-cell interleukin-2 expression at the level of purine-box/nuclear factor of activated T-cells and NF-kappaB transcriptional act iy at ion. J Biol Chem. 1999. 274(19) : 13443-13450. 实施例5 HSP27敲除增强了雷公藤甲素或顺钼的细胞毒性采取三对干扰片断SiRNAOOl，SiRNA002，SiRNA003，对HSP27基因进行敲除。如图5所示，经Wfestern blotting证实SiRNA 03是HSP27最有效的干扰片断。与阳性对照寡核苷酸相比，沉默HSP27基因，使各剂量的雷公藤甲素或顺钼对细胞的杀伤作用明显增强。提示 HSP27下调可增强胰腺癌细胞对雷公藤甲素或顺钼的敏感性，可能是雷公藤甲素和顺钼联合运用化学治疗敏感性增强的重要原因。
实施例6雷公藤甲素和顺钼联合运用显著地抑制了肿瘤的生长PANC-I细胞(5X106)被接种到6周龄裸鼠的侧腹的皮下。4天后，将成功接种了异位肿瘤的裸鼠分成四组，分别给予含1% DMSO的生理盐水(1次/2天)、雷公藤甲素0.25 mg/ kg (1次/2天)、顺钼3mg/kg (1次/1周)以及联合给予雷公藤甲素和顺钼。25天后，处死裸鼠，切除肿瘤，测定肿瘤大小。
将肿瘤组织用4%的福尔马林缓冲液固定M小时，用石蜡包埋。进行热固定、除去石蜡以及重新水化后，将组织切片浸入IOmM柠檬酸缓冲液(pH 6.0)微波lOmin。组织切片与1. 5%的block serum培养1小时，然后与HSP27抗体4°C孵育过夜。结合了 HPR的第二抗体1小时。最后，组织切片用Gills Hemtoxylin III进行复染，在倒置显微镜下观察。
在裸鼠异种移植模型上，单独运用低剂量的雷公藤甲素或顺钼，对肿瘤生长无统计学意义的抑制作用。然而，联合运用低剂量的雷公藤甲素和顺钼显著降低了肿瘤的体积和质量。免疫组化结果也表明，药物联合降低了 HSP27。结果如图6所示。
权利要求
1.一种组合物，其特征在于，由雷公藤甲素和顺钼组成，雷公藤甲素和顺钼重量份数比为 1 一 20:2—120。
2.权利要求1所述组合物在制备抗耐药性胰腺癌药物中的应用。
3.权利要求1所述组合物在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了雷公藤甲素顺铂联合运用在制备抗耐药性胰腺癌药物中的应用。在两种耐药性胰腺癌细胞PANC-1和MIAPaCa-2上，以及侧腹接种PANC-1细胞的裸鼠上，证实雷公藤甲素-顺铂联合运用对耐药性胰腺癌具有协同抑瘤作用。到目前为止，还没有关于雷公藤甲素-顺铂联合运用具有协同抑制胰腺癌的研究报导。在裸鼠异种移植模型上，联合运用低剂量的雷公藤甲素和顺铂显著抑制肿瘤的生长，而单用雷公藤甲素或顺铂均不能引起肿瘤的生长抑制。对各组的肿瘤切片的免疫组化结果表明，两种药物联用显著下调HSP27的蛋白表达，与细胞株上的结果一致。这说明雷公藤甲素和顺铂联合运用能作为抗肿瘤药物的增敏剂。
文档编号A61K31/585GK102499942SQ20111038450
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月28日 优先权日2011年11月28日
发明者朱文博, 李晶洁, 胡海燕 申请人:广州市赛普特医药科技有限公司