专利名称：一种自南蛇藤根皮中提取雷公藤红素的方法
技术领域：
本发明涉及一种自植物中制备天然化学品的方法，具体的说是一种自南蛇藤根皮中提取 雷公藤红素的方法。
二背景技术：
雷公藤红素(tripterine)分子式为C29H380又 名南蛇藤素(Celastrol)，是一种存在于卫矛科植 物雷公藤、南蛇藤等植物中的五环三萜类物质， 其结构式如图。
以往研究表明，雷公藤红素能抑制多种癌细 胞的增值，包括白血病、神经胶质瘤、前列腺 癌等。此外，有证据显示，雷公藤红素能参与 促炎症细胞因子、诱导性一氧化氮合酶、黏附 分子、蛋白酶体活性、拓扑异构酶、钾通道以
及热休克应答等调控。在体内研究方面，雷公藤红素能显著的抑制前列腺癌以及胰腺癌细胞 小鼠肿瘤抑制模型中癌细胞的增值，并且在系统性红斑狼疮、哮喘、类风湿性关节炎以及胶 原诱导的关节炎等动物模型中显示有效的抗炎症作用。因此，无论在科研还是药物研发中雷 公藤红素的需求越来越大。雷公藤红素在已报道的植物中含量极低，目前多采用常压反复硅 胶柱层析进行分离，得率低，毒性大，而且有毒溶剂消耗也大。
中国专利20071002543.3公开了南蛇藤茎总萜提取物及其制备方法及用途。特点是从南 蛇藤属植物南蛇藤茎中提取分离而得到含有南蛇藤茎总二、三萜的提取物。工艺采用95% 乙醇提取，乙酸乙酯萃取后即得南蛇藤茎总二、三萜，优点在于原料提取率高，成本低，操 作简便，但是未提及雷公藤红素的单体制备。
中国专利200710041518.X公开了南蛇藤素的碱金属盐化合物及其制备方法。其特点是 一种水溶性南蛇藤素碱金属盐化合物及其制备方法，可制成药学上的各种剂型，包括注射剂， 特别是用于制造注射剂用粉针剂。
中国专利200710039694.X公开了南蛇藤葡甲胺炎及其制备方法。其特点是采用选择性 的只有南蛇藤分子中羧基参与成盐的南蛇藤葡甲胺盐，可制成药学上的各种剂型。
中国专利200510121360.8公开了一种南蛇藤中成药及其在抗类风湿关节炎中的应用。其特点是从卫茅科南蛇藤属植物南蛇藤中提取分离而得到含有南蛇藤总萜类的提取物，经药 效学及毒理学实验证明，该提取物对类风湿关节炎具有较好的治疗作用。
美国专利号US4328309公开了用植物细胞培养方法来制备雷公藤甲素、雷公藤红素等 活性成分。
发明内容
本发明旨在提供高纯度的雷公藤红素，所要解决的技术问题是遴选雷公藤红素含量丰富 的植物源及其提取方法。
研究表明，在植物源南蛇藤中，雷公藤红素含量最为丰富，且多集中在其根皮部位。所 以本发明的技术方案是以南蛇藤根皮粉为原料，包括提取、分离、纯化、重结晶，所述的提 取包括动态回流提取和静态醇沉萃取，动态回流提取是南蛇藤根皮粉按1 : 3 20的质量比 加入低级氯代垸烃加热回流提取不少于2小时，冷却、分离、提取液脱溶得到暗红色浸膏状 初提物；静态醇沉萃取是向上述初提物中加入浓度50 70vty。(体积百分比，下同)的甲醇或 乙醇溶液，充分搅拌后静置萃取，待白色析出物沉淀完全后分离，萃取液脱溶得到红色稠膏 状粗提物所述的纯化是将粗提物溶于甲醇中用固定相为正相硅胶或者反相ds或Cs硅胶的 柱色谱分离纯化，等度洗脱，收集洗脱液，脱溶、干燥后得到红色粉末状精提物，精提物经 重结晶得到纯度》98%红色结晶状雷公藤红素。
所述的低级氯代烷烃选自三氯甲烷(氯仿)或1， 2-二氯乙垸(均二氯乙烷)或1， 1， 1-三氯乙烷(偏三氯乙院)等a
所述的正相硅胶柱色谱固定相为200 300目正相硅胶，洗脱液(流动相)为氯仿-甲醇 (体积比70 : 30 50 : 50)混合液。
所述的反相ds或C8硅胶柱色谱固定相相为U或C8反相硅胶，洗脱液(流动相)为pH值 3 4的75 87vt。/。乙醇或甲醇溶液。
重结晶所用溶剂为乙醇一水(体积比90: 10 70: 30)混合溶剂。
具体操作如下
1、 回流提取选取南蛇藤根皮部粉末，按质量比加入3 20倍量的1， 2-二氯乙烷，加 热回流提取2-6小时，然后冷却静置、分离、过滤，滤液减压浓縮回收溶剂得初提物，呈暗 红色浸膏状。
2、 醇沉萃取将1步骤所得的雷公藤红素初提物溶于50%—70讨％的甲醇或乙醇溶液， 静置取上清液或过滤取滤液浓縮得到粗提物，呈红色稠膏状。。
3、 将2步骤得到的粗提物溶于甲醇中进行固定相为正相硅胶的柱色谱分离，洗脱方式为氯仿与甲醇混合体系(70: 30-50: 50)等度洗脱，TLC跟踪监测雷公藤红素馏分，收集
馏分浓縮。
4、 将2步骤得到的粗提物溶于甲醇中进行固定相为反相ds或C8硅胶的柱色谱分离， 流动相为加酸调整pH值为3 4的浓度75 87vt。/。的乙醇或者甲醇溶液等度洗脱，HPLC-UV 监测收集洗脱液。
5、 柱色谱分离后的馏分或洗脱液浓縮，干燥后得到红色粉末，采用两相溶剂结晶法进 一步纯化得到纯度达98%的红色结晶产品，所用溶剂为75 90vt。/。乙醇溶液。
雷公藤红素的测定方法为
1、 高效液相制备色谱法(HPLC—UV)，色谱固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，检测波长 425nm，流动相为甲醇-1%醋酸(体积比87: 13)，流速为lml/min，柱温27。C，进样量 10u 1。
2、 200-300目G硅胶铺板，展开剂l:氯仿-甲醇(体积比65: 35)， pH调至3-4;展开剂2:
环己垸一丙酮(体积比1: 3);
显色方式碘显色或者香草醛硫酸乙醇溶解，105。C加热显色
本申请利用雷公藤红素既溶于氯代烷烃又溶于50 70vt。/。甲醇或乙醇溶液的物理性质以 及氯代烷烃与醇溶液极性差异的特点，首先使用氯代烷烃提取，将仅溶于醇溶液而不溶于氯 代垸烃的非目标产物分离，然后用醇溶液萃取，将在醇溶液中有较小溶解度的另一些非目标 产物沉淀分离，这时醇溶液中所含非目标产物大大减少，使粗提物中雷公藤红素含量较初提 物大幅度提高，从而简化以后的分离纯化过程。
四
图1为2步骤制备的粗提物HPLC检测图谱
图2为4步骤制备的精提物的HPLC检测图谱
图3、图4为4步骤制备的精提物的"C丽R1， H画R检测图谱
图5为4步骤制备的精提物的EI-MS检测图谱
五具体实施方式
实施例一
选取粒度为20目的南蛇藤根皮部分粗粉300g，按1: 5的质量比加入1， 2-二氯乙烷， 加热回流提取4小时，回流提取两次。过滤，合并滤液减压浓縮回收l， 2-二氯乙烷后，得 暗红色浸膏0. 39g(初提物)，红素含量9. 2%。加50vt。/。甲醇溶液溶解，溶液中析出白色沉淀， 静置，取上清液浓縮后重复处理2-3次，得到雷公藤红素粗提物，雷公藤红素含量51.3%。
5将粗提物甲醇溶解进行固定相为反相Ci8制备色谱上进行分离，洗脱剂为83vt^甲醇水溶液， 醋酸调pH至3，根据制备色谱图收集雷公藤红素馏分，浓縮蒸干后得雷公藤红素粉末(精提 物)，采用乙醇/水重结晶处理得到纯度达98%的红色结晶雷公藤红素产品。 实施例二
选取粒度为20目的南蛇藤根皮部分粗粉300g，按l: 7的质量比加入偏三氯乙烷，加热 回流提取5小时，回流提取两次。过滤，合并滤液减压浓縮回收偏三氯乙烷后，得暗红色浸 膏0.41g(初提物)，雷公藤红素含量10.3%。加入60vtX乙醇溶液充分溶解，溶液中析出 白色沉淀，过滤后取滤液，浓縮后再次重复同样处理2-3次，得到雷公藤红素粗提物，雷公 藤红素含量48.2%。将粗提物甲醇溶解进行固定相为反相d8制备色谱上进行分离，洗脱剂 为85"%甲醇溶液，醋酸调pH至3，根据制备色谱图收集雷公藤红素馏分，浓縮蒸干后得 雷公藤红素粉末(精提物)，釆用乙醇/水重结晶处理得到纯度达98%的红色结晶雷公藤红素
实施例三
选取粒度为20目的南蛇藤根皮部分粗粉300g，按l: IO的质量比加入氯仿，加热回流 提取5小时，回流提取两次。过滤，合并滤液减压浓縮回收氯仿后，得暗红色浸膏0.47g(初 提物)，雷公藤红素含量10. 1%。加入60vt^甲醇溶液，溶液混浊，静置，过滤取滤液浓縮 后再次重复同样处理2-3次，得到雷公藤红素粗提物，雷公藤红素含量53. 1% 。将粗提物 甲醇溶解硅胶拌样进行固定相为正相硅胶常压柱分离，洗脱剂为氯仿/甲醇(60: 40)等度洗 脱，TLC跟踪监测，收集雷公藤红素馏分，浓縮蒸干后得到雷公藤红素产精提物，采用乙醇 /水重结晶处理得到纯度达98%的红色结晶雷公藤红素产品。 实施例四
选取粒度为20目的南蛇藤根皮部分粗粉300g，按l: 15的质量比加入氯仿，加热回流 提取5小时，回流提取两次。过滤，合并滤液减压浓縮回收氯仿后，得暗红色浸膏0.41g(初 提物)，雷公藤红素含量9.2%。加入50vtX乙醇溶液，溶液混浊，静置，过滤取滤液浓縮 后再次重复同样处理2-3次，得到雷公藤红素粗提物，雷公藤红素含量50. 1% 。将粗提物 甲醇溶解硅胶拌样进行固定相为正相硅胶常压柱分离，洗脱剂为氯仿/甲醇(70:30)等度洗 脱，TLC跟踪监测，收集雷公藤红素馏分，浓縮蒸干后得到雷公藤红素精提物，采用乙醇/ 水重结晶处理得到纯度达98%的红色结晶雷公藤红素产品。
权利要求
1、一种自南蛇藤根皮中提取雷公藤红素的方法，以南蛇藤根皮粉为原料，包括提取、分离、纯化和重结晶，其特征在于所述的提取首先以低级氯代烷烃为溶剂，加热回流提取，根皮粉与溶剂的质量比1∶3～20，时间不少于2小时，提取液脱溶后得到浸膏状初提物，然后向初提物中加入50～70vt％甲醇或乙醇溶液，充分搅拌、静置萃取，萃取液脱溶后得到稠膏状粗提物；所述的纯化是粗提物用甲醇溶解后用固定相为正相硅胶或反相硅胶的柱色谱分离纯化，收集洗脱液，脱溶干燥后得到粉末状精提物，最后用乙醇-水混合溶剂重结晶。
2、 根据要得要求1所述的方法，其特征在于所述的低级氯化垸烃选自氯仿或均二氯 乙烷或偏三氯乙烷。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于正相硅胶柱色谱固定相为200 300 目正相硅胶，洗脱液为氯仿-甲醇混合溶剂，体积比70 : 30 50 : 50。
4、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于反相硅胶柱色谱固定相为C,8或Cs 反相硅胶；洗脱液为pH3 4的75 87"%甲醇或乙醇溶液。
全文摘要
一种自南蛇藤根皮中提取雷公藤红素的方法，以南蛇藤根皮粉为原料，包括提取、分离、纯化和重结晶，所述的提取首先以低级氯代烷烃为溶剂，加热回流提取，根皮粉与溶剂的质量比1∶3～20，时间不少于2小时，提取液脱溶后得到浸膏状初提物，然后向初提物中加入50～70vt％甲醇或乙醇溶液，充分搅拌、静置萃取，萃取液脱溶后得到稠膏状粗提物；所述的纯化是粗提物用甲醇溶解后用固定相为正相硅胶或反相硅胶的柱色谱分离纯化，收集洗脱液，脱溶干燥后得到粉末状精提物，最后用乙醇-水混合溶剂重结晶。本方法分离、纯化工艺简单，得到纯度达98％的雷公藤红素。
文档编号C07J63/00GK101638425SQ200910144620
公开日2010年2月3日 申请日期2009年8月24日 优先权日2009年8月24日
发明者杨 吕, 许舒雯, 兰 陈, 陈龙胜 申请人:安徽省科学技术研究院