一种雷公藤中未知的倍半萜吡啶生物碱的快速分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及雷公藤中未知的倍半萜吡啶生物碱成分的独立、 快速分析。
【背景技术】
[0002] 雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook.f.)系卫矛科雷公藤属植物，主要分布在 中国南方，是一种重要的传统中药材。用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、红斑狼仓、接触 性皮炎等自身免疫性疾病，均有显著性疗效。
[0003] 倍半萜吡啶生物碱是雷公藤属植物中一类非常重要的活性成分，研宄表明该类化 合物具有抗免疫、杀虫、抗-HIV(J.Nat.Prod. 2000, 63, 357)、抗癌等活性。因此，吸引了众 多的科学家来进行研宄。高效的分析方法对生物领域的研宄至关重要，因为生物领域往 往涉及痕量分析。目前主要的分析是核磁共振，但核磁鉴定需要获得纯品，因此无法实现 对雷公藤中含量相对很低的未知的倍半萜吡啶生物碱进行快速分析。液质联用技术是一 种重要的分析复杂体系中未知痕量物质的方法，目前的方法往往需要数据库（J.Am.Chem. Soc. 2009, 131，5030 ;Anal.Chem. 2008, 80, 1280)，但液质联用的数据库十分有限，不同的仪 器之间二级质谱的重现性较差，此外，获得痕量的标准天然产物是十分困难的；植物中存在 众多的同分异构体增加了分析的困难。因此，需要建立一种实用的、快速的分析方法用于 雷公藤中未知的倍半萜吡啶生物碱的快速分析。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种可靠、快速的质谱方法用于雷公藤中未知的倍半萜吡啶 生物碱的快速分析。本方法结合液相色谱分离技术，利用两种方法获得获得提取物中化合 物二级质谱图，通过二级质谱的轮廓图并结合二级质谱中的特征离子对未知的倍半萜吡啶 生物碱化合物进行分析。
[0005] 因此，本发明提供的雷公藤中未知的倍半萜吡啶生物碱的分析方法包括如下步 骤：（1)雷公藤中活性成分提取；（2)利用电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪对已知的单一 倍半萜吡啶生物碱的碎片离子进行分析；（ 3)液质联用分析，即利用高效液相色谱-电喷 雾-四级杆-飞行时间质谱仪获得复杂体系中倍半萜吡啶生物碱的二级质谱，即获得未知 化合物的碎片离子；(4)通过比较已知化合物与复杂体系中倍半萜吡啶生物碱碎片离子的 轮廓图以及比较它们的特征碎片离子，从而实现对复杂体系中未知的倍半萜吡啶生物碱进 行快速的结构分析分析。
[0006] 具体地，本发明提供的雷公藤中未知的倍半萜吡啶生物碱的分析方法包括如下步 骤：
[0007] (1).雷公藤活性成分的提取
[0008] 对雷公藤中的活性成分进行针对性的超声浸提，其中浸提溶解试剂为水、甲醇、乙 氰、丙酮、氯仿或者上述溶剂的任意两者的混合溶剂，超声时间为1-5小时，然后进行过滤。 本发明方法提取过程既要尽可能获得多的活性成分，又要尽量去掉其它成分例如色素、糖 等的干扰。
[0009] (2).已知的单一倍半萜吡啶生物碱的碎片离子分析
[0010] 利用电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪对已知的14种单一倍半萜吡啶生物碱的 碎片离子进行分析（表一），根据这14种化合物的结构特点、裂解方式以及二级谱图的轮廓 分成7个类型。裂解方式主要有侧链断裂，骨架断裂的，以及碎片之间进行加和反应。其中 与C-1相连接的侧链易发生加和反应，与C-2相连接的侧链容易丢失。
[0011] (3).液质联用分析
[0012] 利用高效液相色谱对步骤（1)中获得的混合物进行分离，选择C18柱，相应的分离 条件（包括色谱柱的长度、内径、填料、流速、流动相组成、洗脱梯度、不同的电解质）、质谱 条件（仪器的参数）通过图谱进行优化。应用液相色谱-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱 仪在正离子模式下进行全扫描分析（其中电喷雾-四级杆-飞行时间质谱是一个完整的设 备，可用于获得一级与二级质谱的谱图）。利用两种方法选择碰撞能来获得碎片离子轮廓 图，其中分别利用恒定的与梯度的碰撞能来获得碎片离子的轮廓图，其中梯度的碰撞能与 化合物的分子量成正比。
[0013] (4).雷公藤提取物中倍半萜吡啶生物碱的结构分析
[0014] 通过比较已知与复杂体系中倍半萜吡啶生物碱碎片离子的轮廓图以及比较它们 的特征碎片离子，来鉴别不同类型的未知倍半萜吡啶生物碱化合物，其包括：其中谱图中碎 片离子m/z206,204,或194是吡啶部分的特征离子；其中m/z310是两个碎片离子进行加 和反应产生的，该离子与侧链位置相关，可用于鉴定侧链位置；其它的碎片离子主要来自于 侧链丢失；化合物分子量在800Da以上时，选择恒定能量方法更适合用于鉴定未知化合物， 化合物分子量在800Da以下时，选择梯度能量方法更适合用于鉴定未知化合物。
[0015] 本发明具有以下优点：
[0016] 1.可以快速地、独立地完成对雷公藤中倍半萜吡啶生物碱成分，包括未知的化合 物的结构鉴定，不需要结合其他的分析手段。
[0017] 2.可以快速地、独立地完成对雷公藤中倍半萜吡啶生物碱成分的分析，包括某些 侧链位置的确定。
[0018] 3.两个碰撞能的选择既提高了鉴定的可信度，又避免了数据的繁琐，可用于高通 量分析。
【附图说明】
[0019] 表一是已知的单一倍半猫P比啶生物碱的碎片离子质谱分析（碰撞能：25eV).
[0020] 图一是（a)已知化合物cangorinineE-1的二级图谱，（b)已知化合物wilforine 的二级图谱和（c)未知知化合物A的二级图谱；
[0021] 图二是（a)已知化合物euonymine的二级图谱，（b)未知化合物B的二级图谱（碰 撞能为21eV)和（c)未知知化合物B的二级图谱（碰撞能为25eV)。
【具体实施方式】
[0022] 以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非 对本发明的限制。
[0023] 实施例1:
[0024] (1).雷公藤活性成分提取
[0025] 雷公藤购于成都荷花池市场，100%甲醇超声浸泡一小时后低压浓缩过滤，获得相 应的固体。
[0026] (2).对已知的单一倍半萜吡啶生物碱的碎片离子进行分析
[0027]仪器：布鲁克公司ESI-Q_T0F(micr0T0FQ)
[0028] 质谱条件：离子化模式，正离子模式（+);喷雾气压力，30psi;氩气为碰撞气，碰撞 能，25eV;干燥气温度，180°C;毛细管端口电压，-4500V，金属盖电压，-4000V。
[0029]对已知化合物cangorinineE-1的二级图谱进行分析（附图一（a))，研宄发现 高质量区的碎片离子主要通过断裂侧链丢失，低质量区的碎片离子，例如m/z206主要是 吡啶部分的特征离子，特征的碎片离子m/z310通过加和反应形成。尽管已知的化合物 wilforine与cangorinineE-1是同分异构体，结构也十分相似，然而它们二级谱图的轮廓 图并不相同（附图一（b))，更重要的是在化合物wilforine的二级谱图中没有特征的碎片 离子m/z310,这说明该离子的形成与苯甲酸侧链的取代位置相关。
[0030] (3).液质联用对粗提物进行分析
[0031]仪器：布鲁克公司HPLC-ESI-Q-TOF(micrOTOFQ)
[0032] 色谱条件：安捷伦C18色谱柱（4. 6X150,3. 5ym);进样量：10yl;流速：1.0ml/ min;流动相