雷公藤甲素诱导建立的卵巢癌多药耐药细胞株及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人卵巢癌耐药细胞株及其用途，具体涉及以人卵巢癌SKOV3为亲 代细胞，通过逐步增加化疗药物雷公藤甲素（TPL)作用浓度，建立了卵巢癌多药耐药细胞 株SKOV3/TPL，属于肿瘤生物学领域。
【背景技术】
[0002] 在最近一次世界范围内肿瘤发病率统计中，卵巢癌发病率位居女性生殖器官恶性 肿瘤中第三位，病死率高居第一位，严重危害着女性的健康及生命。化疗是卵巢癌治疗的重 要手段之一，在卵巢癌的综合治疗中占有重要的地位，但临床上化疗耐药是导致卵巢癌化 疗失败的主要原因。耐药性的产生是多因素的，与药物的传输、代谢和细胞修复的改变都有 关系。雷公藤甲素（triptolide，TPL)是植物雷公藤的主要有效成份之一，具有抗肿瘤、抗 炎、抗生育和调节免疫等生物活性。近几年人们对TPL治疗癌症的机制做了大量的研宄。 发现TPL对肺癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌等多种实体瘤细胞具有广谱的细胞毒效应； 还能与多种化疗药物协同作用，增强化疗效果或逆转肿瘤细胞耐药。经体内外研宄证实，与 传统抗肿瘤药物多柔比星、丝裂霉素、顺铂、紫杉醇相比TPL具有更强的抗肿瘤活性，因此 采用TPL治疗也成为了最有希望的卵巢癌治疗途径之一。但不得不令人们关注的另一个事 实是，在长期的体外细胞培养过程中，仍会出现TPL耐药现象进而导致肿瘤的恶性发展。本 发明通过建立TPL诱导的卵巢癌耐药株，来探讨此类药物在未来卵巢癌治疗的可行性与疗 效，进而为其可能产生耐药的机制提供理论依据。SK0V3细胞是卵巢腺癌细胞株，来源于卵 巢癌患者腹水，由美国G. Trempe于1973年建立，是研宄卵巢癌很常用的一种细胞株。目前， 国内外尚没有SK0V3对TPL的耐药细胞株，因此有必要建立该耐药肿瘤细胞株。
[0003] 肿瘤耐药细胞株的建立通常有两种方法，一是逐步增加药物浓度、持续诱导法，二 是大剂量冲击间断给药法。国内外均有研宄对这两种方法进行比较，认为不同诱导方式可 能获得不同耐药机理的耐药细胞株，同时也可能影响肿瘤细胞耐药程度，持续诱导比冲击 诱导更易产生耐药性。持续诱导法以肿瘤细胞最终能在特定浓度化疗药物中稳定生长作为 诱导成功的判定标准，细胞耐药性稳定、直观，因此本发明主要采用该方法来诱导耐药细胞 的产生。
[0004] 肿瘤细胞耐药程度的判定常用耐药指数（resistant index，RI)来表示，RI是耐 药细胞半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC5tl)与亲代细胞半数抑制浓度的 比值。Snow等按照耐药指数的高低将耐药性分为低度（< 5)、中度（5-15)、高度（> 15)。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于建立卵巢癌多药耐药细胞株SK0V3/TPL，为肿瘤相关研宄提供 耐药肿瘤细胞模型，并可通过对比其与亲代细胞的遗传差异进而研宄药物的作用机制。
[0006] 本发明选择人卵巢癌SK0V3细胞株作为亲代细胞，从IOnM逐步增加中药雷公藤 的单体提取物雷公藤甲素（Triptolide，TPL)的作用浓度至400nM，建立了一种卵巢癌多 药耐药细胞株，命名为SK0V3/TPL，分类命名为人卵巢癌细胞系，微生物保藏号为CGMCC No. 10306,保藏日期为2015年Ol月04日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。
[0007] 本发明进一步提供了制备所述的卵巢癌多药耐药细胞株的方法，其特征在于：包 括以下步骤：（1)人卵巢癌SK0V3细胞株，复苏后用含10%小牛血清、lOOU/ml青霉素和 100U/ml链霉素的1640培养液于37°C、5% C02、95%湿度条件下培养；
[0008] (2)取对数生长期SK0V3细胞，换新鲜培养液，加入雷公藤甲素（TPL)，使其作用浓 度为10nM，在37°C、5% C02、95%湿度条件下继续培养，适时换液，维持IOnM药物浓度直至 存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
[0009] (3)适当增加 TPL的作用浓度，在37°0、5%〇)2、95%湿度条件下继续培养，适时换 液，维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
[0010] (4)重复步骤（3)直到获得能在400nM TPL中稳定生长、传代及复苏的SK0V3/TPL 细胞株。
[0011] 在本发明中，优选的，步骤（3)每次增加 TPL的作用浓度为50nM。
[0012] 在诱导过程中，确定适当的TPL增加浓度非常重要，理想状况是既通过增加药物 浓度筛选出少数耐药细胞又不致于使全部细胞死亡，从而不断获得有更高耐药性的SK0V3 细胞。经过探索，在我们的发明中采用每次增加50nM TPL的方法取得了较好效果，历时9个 月建立了 SK0V3/TPL耐药细胞株。用光学显微镜观察细胞形态、MTT法绘制细胞生长曲线、 检测细胞耐药指数。我们发现，SK0V3/TPL细胞大小、形态不一，生长速度明显减慢，对TPL 明显耐药，耐药指数（RI)为50. 95,除对TPL耐药外，对MTX、5-FU、Ara-C、GEM、VP-16、MMC、 ADM、MIT、TAX、VCR 有交叉耐药。
[0013] 本发明提供了所述的卵巢癌多药耐药细胞株在肿瘤相关研宄中的应用。
【附图说明】
[0014] 图1是倒置相差显微镜下SK0V3活细胞观察图；
[0015] 图2是倒置相差显微镜下SK0V3/TPL活细胞观察图；
[0016] 图3是光学显微镜下SK0V3细胞爬片HE染色观察图；
[0017] 图4是光学显微镜下SK0V3/TPL细胞爬片HE染色观察图；
[0018] 图5是SK0V3及SK0V3/TPL细胞生长曲线图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0020] 实施例1卵巢癌多药耐药细胞株SK0V3/TPL的诱导建立
[0021] SK0V3/TPL多药耐药细胞株按以下步骤建立：（1)人卵巢癌SK0V3细胞株，复苏后 用1640培养液（含10%小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)于37°C、5%C0 2、95% 湿度条件下培养；（2)取对数生长期SK0V3细胞，换新鲜培养液，加入雷公藤甲素（TPL)Ji 其作用浓度为ΙΟηΜ，在37°C、5% C02、95%湿度条件下继续培养，适时换液，维持IOnM药物 浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；（3)适当增加 TPL的作用浓度，在37°C、5% C02、95 %湿度条件下继续培养，适时换液，维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生 长、传代；（4)重复步骤（3)直到获得能在400nM TPL中稳定生长、传代及复苏的SK0V3/TPL 细胞株。每阶段增加 TPL量为50nM。
[0022] 当细胞依次对 10nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM TPL稳 定耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中。冻存液由20%小牛血清、10% DMS0、70% 1640培养液组成，冻存过程应逐步降温，采取4°C 30分钟一-20°C 1小时一-70°C过夜一 液氮的顺序进行。冻存细胞的复苏按以下程