专利名称：重组家蚕抗菌肽cm4的高效生产方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域重组蛋白质的表达和纯化，尤其是涉及重组家蚕抗菌肽CM4的高效生产方法。
背景技术：
抗菌肽是先天性免疫的分子受动器，通常它们含有15-45个氨基酸残基，净电荷为正。Cecropins类型的不含半胱氨酸线性肽是最早发现的，来源于昆虫。现已发现抗菌肽、蛋白有800个以上，来源于动物、植物领域。抗菌肽主要作用靶点是细菌的膜，而且杀伤过程必须比细菌生长的速度快。人们发现许多传统的抗生素，特别是青霉素，能够诱导耐药菌株的产生。为了解决抗生素耐药性的问题，研制新的抗生素或抗菌肽就显得特别重要。抗菌肽具有良好的抗菌选择性和独特的抗菌模式，而且不会诱导产生耐药菌株，容易被降解，不易在微生物体内富集，因此，被认为能够成为替代抗生素的首选药物。
家蚕抗菌肽CM4是由张双全等人从中国家蚕血淋巴中提取的，与Cecropins家族的成员相似，它也有两亲性的α-螺旋结构区域，属于Cecropins家族，含35个氨基酸残基，分子量约为3.5KD，有很强的杀菌能力，对细菌、病原菌、真菌及病毒都有作用。
目前，许多抗菌肽正在开发成药，但是抗菌肽天然产量非常低，合成肽价格相当昂贵，这成为开发成药的一个瓶颈，通过基因工程技术生产抗菌肽具有广阔的应用前景。
有报道曾采用大肠杆菌表达系统以融合蛋白的形式表达家蚕抗菌肽CM4，结果不是十分理想。近年来，以酵母菌为基因工程受体菌的研究日益受到人们重视。尤其是甲醇营养酵母表达系统，该系统已成为极为成功的外源蛋白表达系统之一，具有许多优点(1)利用受甲醇诱导的醇氧化酶(alochol oxidaseI AOXI)启动子，可严格控制外源基因的表达，无论胞内、胞外均可实现外源基因的高表达；(2)毕赤酵母生长快速，培养条件简单，适合高密度培养，发酵后每升培养液中细胞湿重可达450g，有利于提高目的蛋白产量；(3)毕赤酵母作为一种真核细胞生物，可进行翻译后的蛋白加工，以使外源蛋白得到正确的折叠和修饰等优点。国内外也有报道用毕赤酵母系统表达抗菌肽(黄亚东抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达华南理工大学学报，2002，30(2)，13-16)，但毕赤酵母表达系统分泌表达家蚕抗菌肽CM4，目前尚无报道。
发明内容
本发明提供了一种采用真核表达系统表达重组家蚕抗菌肽CM4的高效生产方法。
本发明的技术方案为一种重组家蚕抗菌肽CM4的高效生产方法，包括以下步骤(1)应用重组DNA技术，构建ABP-CM4真核表达载体，载体构建见图1；(2)ABP-CM4真核表达载体转化宿主细胞毕赤酵母菌，构建表达工程菌；
(3)发酵培养工程菌，进行甲醇诱导表达；(4)表达产物经分子筛柱层析纯化得重组家蚕抗菌肽CM4产品。
本发明优选的技术方案推荐步骤(3)具体为用BMGY、28℃～30℃发酵培养表达工程菌约20h至OD600达到2-6；离心，用BMMY重悬至OD600约为1.0，20℃～30℃培养约72h，每隔24h加100％甲醇至甲醇体积百分浓度为0.5-3％，最好是0.5％。
步骤(4)具体为表达上清冻干，溶于灭菌水，煮沸，低温离心去除沉淀，分子筛柱层析分离介质为sephadex G50，用0.05M，PH5.1醋酸氨缓冲液平衡5个柱体积，上样；0.05M，PH5.1醋酸氨缓冲液洗脱，收集蛋白洗脱峰，得产品。
本发明进一步优选的技术方案是，在步骤(3)培养表达过程中添加酸水解酪素。
本发明应用基因工程技术在真核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽CM4，经实验验证该重组抗菌肽CM4对多种真菌具有杀菌作用，且本发明表达效率高，分离纯化简单，易操作，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产。因此，本发明对研制新型高效抗感染药物具有重要价值，在制药行业具有广阔的应用前景。
图1是表达载体构建示意图；图2是酸水解酪素浓度与产物表达量的关系的示意图；图3是甲醇浓度与产物表达量的关系的示意图；
图4是诱导时间与产物表达量的关系的示意图；图5是层析及抗菌活性分析图；图6是纯化产品的Tricine-SDS-PAGE电泳分析；其中泳道N为天然抗菌肽；泳道M为小分子Marker；泳道R为本发明纯化产品；图7是纯化产品的酸性测活电泳分析；其中4为抑菌圈；图8是纯化产品对黑曲霉的抑菌作用；其中C为阴性对照，1、2、3为抑菌圈；图9是纯化产品对绿色木霉的抑菌作用；其中C为阴性对照，1、2、3为抑菌圈；具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1(1)构建表达载体根据毕赤酵母基因翻译的偏爱密码子和抗菌肽CM4氨基酸序列，pPIC9的多克隆位点，设计合成两条引物如下ABP-F 5′agatggaagattttcaagaagatcgagaaggtcggtcaaaacatcagagacggtatcgt3′ABP-R 5′aatagtagcagcttgaccgacgacagcgacagctggaccagccttgacgataccgtctc3′酶切位点为Xho I和Xba I，表达质粒为pPICZaA，载体构建见图1；(2)构建基因工程菌用上述表达载体转化宿主菌，宿主菌株为酵母GS115；(3)诱导表达用BMGY、28℃～30℃发酵培养表达工程菌约20h至OD600达到2-6；离心，用BMMY重悬至OD600约为1.0，20℃～30℃培养，每隔24h加100％甲醇至甲醇体积百分浓度为0.5-3％；分析甲醇不同终浓度对表达的影响如图3所示。
(4)纯化表达上清冻干，溶于灭菌水中；煮沸10～30min，4℃，10000rpm离心5min；采用分子筛层析(分离介质为sephadex G50)，用0.05M，PH5.1醋酸氨缓冲液平衡5个柱体积(1.5×40cm)，流速为1ml/min；上述样品上样；0.05M，PH5.1醋酸氨缓冲液洗脱(0.5ml/min)，收集有抑菌活性蛋白洗脱液。
实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于，诱导表达过程中，于BMMY中添加1-3％(W/V)酸水解酪素抑制降解。分析酸水解酪素添加量与表达产物的关系如图2所示。
采用分子筛层析(分离介质为sephadex G50)，用0.05M，PH5.1醋酸氨缓冲液平衡5个柱体积(1.5×40cm)，流速为0.5ml/min；上述样品上样；0.05M，PH5.1醋酸氨缓冲液洗脱(0.15ml/min)，层析及抗菌活性分析图5所示，收集有抑菌活性蛋白洗脱液。
实施例3与实施例2相同的方法，分析甲醇诱导培养时间与表达产物的关系如图4所示。
实施例4Tricine-SDS-PAGE检测制备15％浓度的分离胶(尿素)，10％浓度的中间胶及4％浓度的浓缩胶；最终纯化样品浓缩10倍，与2×上样缓冲液(4％SDS，12％甘油，50mMTris，2％巯基乙醇，0.01％溴酚蓝，6N HCl调PH到6.8)混合，沸水浴5min后上样电泳，固定液(50％甲醇，10％醋酸)固定30min，考马思亮蓝G-250染色1h，再用脱色液脱色。如图6所示，分离纯化后的样品经Tricine-SDS-PAGE检测分析，每升发酵液可得到纯度大于96％样品15mg。
实施例5酸性电泳鉴定制备15％连续胶(活性)，样品与上样缓冲液混合直接上样，100V，跑5h；胶用灭菌液体LB中和30min，在胶上铺一层含1％E.coliK12D31的固体LB，置37℃过夜，如图7所示，出现抑菌圈4。
实施例6纯化产物的敏感真菌筛选黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、绿色木霉(Trichodermaviride)、串珠镰孢(Fusarium moniliforme)、棉枯病(Fusariumoxyporium)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、白色念珠菌(Candidaalbicans)等接种于马铃薯培养基(PDA)上，28℃，5天。用无菌水冲洗，100ul孢子悬浮液(104/ml)涂布于马铃薯培养基，并在上打5mm的孔，孔c为对照，加未诱导的上清，其余各孔加经纯化的产品，28℃培养3天，与图8、图9所示基本相同，出现抑菌圈1、2、3。表明上述菌株均对重组家蚕抗菌肽CM4敏感。
权利要求
1.一种重组家蚕抗菌肽CM4的高效生产方法，包括以下步骤(1)应用重组DNA技术，构建ABP-CM4真核表达载体，载体构建见图1；(2)ABP-CM4真核表达载体转化宿主细胞毕赤酵母菌，构建表达工程菌；(3)发酵培养工程菌，进行甲醇诱导表达；(4)表达产物经分子筛柱层析纯化得重组家蚕抗菌肽CM4产品。
2.根据权利要求1所述的重组家蚕抗菌肽CM4的高效生产方法，其特征在于步骤(3)具体为用BMGY、28℃～30℃发酵培养表达工程菌约20h至OD600达到2-6；离心，用BMMY重悬至OD600约为1.0，20℃～30℃培养约72小时，每隔24h加100％甲醇至甲醇体积百分浓度为0.5％。
3.根据权利要求2所述的重组家蚕抗菌肽CM4的高效生产方法，其特征在于步骤(4)具体为表达上清冻干，溶于灭菌水，煮沸，低温离心去除沉淀，分子筛柱层析分离介质为sephadex G50，用0.05M，PH5.1醋酸氨缓冲液平衡5个柱体积，上样；0.05M，PH5.1醋酸氨缓冲液洗脱，收集蛋白洗脱峰，得产品。
4.根据权利要求1至3之一所述的重组家蚕抗菌肽CM4的高效生产方法，其特征在于步骤(3)中还添加酸水解酪素。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域重组蛋白质的表达和纯化，尤其是涉及重组家蚕抗菌肽CM4的高效生产方法。本发明的技术方案为一种重组家蚕抗菌肽CM4的高效生产方法，包括以下步骤(1)应用重组DNA技术，构建ABP－CM4真核表达载体，载体构建见图1；(2)ABP－CM4真核表达载体转化宿主细胞毕赤酵母菌，构建表达工程菌；(3)发酵培养工程菌，进行甲醇诱导表达；(4)表达产物经分子筛柱层析纯化得重组家蚕抗菌肽CM4产品。本发明应用基因工程技术在真核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽CM4，表达效率高，分离纯化简单，易操作，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产，对研制新型高效抗感染药物具有重要价值，在制药行业具有广阔的应用前景。
文档编号C07K1/00GK1654646SQ20051003760
公开日2005年8月17日 申请日期2005年1月4日 优先权日2005年1月4日
发明者张双全, 张 杰 申请人:南京师范大学