抗菌肽His6K及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及抗菌肽His6K及其应用。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽（Antibacterial peptide)，是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件 诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫、抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽。1974 年，瑞典科学家G. Boman等人向眉纹天蚕蛾（Samia Cynthia)蛹注入大肠杆菌后，在血淋巴 细胞中发现了一种具有抗菌活性的碱性多肽类物质。经多年的研究，目前已经从动物、植 物、细菌和病毒中发现了超过2500种抗菌肽，以天然抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽 已达数千种。抗菌肽具有抗细菌、真菌、肿瘤和促进伤口愈合等作用，是生物天然免疫防御 系统的一个重要组成部分。抗菌肽是抗生素的理想替代者，具有极好的市场开发前景。
[0003] 抗菌肽具有极其广阔的应用前景，但由于在生物体内天然抗菌肽含量很少，提取 困难，化学合成抗菌肽成本又太高，很难大规模用于食品和饲料等工业。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是获得抑菌活性较高的抗菌肽。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供了名称为抗菌肽His6K的多肽。
[0006] 本发明所提供的抗菌肽His6K为如下（a)或（b)或（c)的多肽：
[0007] a)序列表的序列2所示多肽；
[0008] b)含有两个以上单拷贝的多肽；所述单拷贝如序列表的序列2所示；
[0009] c)含有a)或b)所述多肽的融合多肽。
[0010] 其中，序列表的序列2由20个氨基酸组成。
[0011] 所述抗菌肽His6K可为序列表的序列2所示的多肽。
[0012] 所述抗菌肽His6K可为序列表的序列5的第86-245位所示的多肽。
[0013] 所述抗菌肽His6K可为序列表的序列5所示的融合多肽。
[0014] 为了使抗菌肽His6K便于纯化，可在序列表中序列2所示多肽或序列表序列5第 86-245位所示多肽的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0015] 表1、标签的序列
[0016]
[0017] 上述抗菌肽His6K可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行蛋白表达得到。上 述抗菌肽His6K的编码基因可通过将序列表中序列4第256- 738位所示的DNA序列或序 列表中序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或 几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得 到。
[0018] 编码所述抗菌肽His6K的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0019] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以 是 RNA，如 mRNA 或 hnRNA 等。
[0020] 所述抗菌肽His6K的核酸分子可为如下al)或a2)或a3)所示的DNA分子：
[0021] al)核苷酸序列是序列表的序列3所示的DNA分子；
[0022] a2)与al)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码氨基酸序列为 序列表的序列2的所不多肽的DNA分子；
[0023] a3)在严格条件下与al)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为序列 表的序列2的所不多肽的DNA分子。
[0024] 所述抗菌肽His6K的核酸分子还可为如下bl) _b6)任一所示的DNA分子：
[0025] bl)核苷酸序列是序列表的序列4第256- 738位所示的DNA分子；
[0026] b2)核苷酸序列是序列表的序列4第1一738位所示的DNA分子；
[0027] b3)与bl)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码氨基酸序列为 序列表的序列5第86-245位所不的多肽的DNA分子；
[0028] b4)与b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码氨基酸序列为 序列表的序列5第1-245位所不的多肽的DNA分子；
[0029] b5)在严格条件下与bl)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为序列 表的序列5第86-245位所不的多肽的DNA分子；
[0030] b6)在严格条件下与b2)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为序列 表的序列5第1-245位所不的多肽的DNA分子。
[0031] 含有编码所述抗菌肽His6K的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基 因细胞系的生物材料也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为在酵母表达载体 pPic9K的多克隆位点（例如限制性内切酶酶切位点XhoI和NotI之间）插入序列表的序 列4自5'末端第250位至第738位所示的DNA分子得到重组质粒。所述重组微生物具体 可为将所述重组质粒导入宿主菌得到的重组菌。所述宿主菌具体可为毕赤酵母，例如毕赤 酵母X-33。所述转基因细胞系不包括繁殖材料。
[0032] 所述抗菌肽His6K在制备抗微生物制剂中的应用也属于本发明的保护范围。所 述抗微生物制剂具体可为抗细菌制剂。所述细菌具体可为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌，例 如ATCC No. 25922的大肠杆菌（Escherichia coli)或ATCC No. 25923的金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)〇
[0033] 本发明还保护一种抗微生物制剂，其活性成分可为编码所述抗菌肽His6K的核 酸分子或含有编码所述抗菌肽His6K的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基 因细胞系的生物材料。所述抗微生物制剂具体可为抗细菌制剂。所述细菌具体可为大肠 杆菌或金黄色葡萄球菌，例如ATCC No. 25922的大肠杆菌（Escherichia coli)或ATCC No. 25923 的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) 〇
[0034] 本发明提供的抗菌肽His6K对细菌（特别是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）具有非 常好抑菌活性，因此具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0035] 图1为质粒pPic9K_His6K结构示意图。
[0036] 图2为质粒pPic9K-His6K酶切鉴定结果。
[0037] 图3为X-33-pPic9K-His6K的PCR扩增产物的分析结果。
[0038] 图4为抗菌肽His6K诱导表达的聚丙酰胺凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0040] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0041] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042] ATCC即美国模式培养物集存库（American type culture collection)，网址为 http://www. atcc. org/〇
[0043] ATCC No. 25922 的大肠杆菌（Escherichia coli)，简称为大肠杆菌 25922。ATCC No. 25923的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)，简称金黄色葡萄球菌25923。大 肠杆菌DH5a :Life Technologies公司产品，产品目录号为18258-012。毕赤酵母（Pichia postros)X_33:Life Technologies公司产品，产品目录号为C181-00。酵母表达载体 pPic9K :Life Technologies 公司产品，产品目录号为 V175-20。
[0044] MD固体培养基：Teknova公司产品，产品目录号为M1304。
[0045] YH)液体培养基：Life Technologies公司产品，产品目录号为A13745-01。
[0046] Yro固体培养基：向Yro液体培养基中加琼脂至其含量为20g/L得到的培养基。
[0047] BMGY液体培养基：溶质及其浓度为：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，1. 34% YNB，4xlO 5%生物素，甘油10g/L ;溶剂为0.1 M磷酸缓冲液；pH6. 0。
[0048] BMMY液体培养基：溶质及其浓度为：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，1. 34% YNB，4x10 5%生物素，0. 5%甲醇水溶液（体积百分比），溶剂为0.1 M磷酸缓冲液；pH6. 0。
[0049] 实施例1、抗菌肽的人工合成与抑菌活性测定
[0050] 一、抗菌肽的人工合成
[0051] 现有技术中的抗菌肽的氨基酸序列如序列表的序列1所示。人工合成序列表的序 列1所示的抗菌肽，将其命名为抗菌肽Histonin。
[0052] 本发明提供的抗菌肽的氨基酸序列如序列表的序列2所示，其编码基因如序列表 的序列3所示。人工合成序列表的序列2所示的抗菌肽，将其命名为抗菌肽His6K。
[0053] 二、抗菌肽最小抑菌浓度MIC的测定
[0054] 分别检测抗菌肽（抗菌肽His6K或抗菌肽Histonin)对各个待测菌（大肠杆菌 25922或金黄色葡萄球菌25923)的最小抑菌浓度MIC，具体步骤如下：
[0055] 1、用LB液体培养基悬浮待测菌，得到菌浓度为l*106CFU/mL的菌悬液。
[0056] 2、取待测抗菌肽，用水溶解并稀释，得到浓度不同的抗菌肽溶液。
[0057] 3、取96孔细胞培养板，加入步骤1制备的菌悬液（每孔50 μ 1)，然后加入步骤2 制备的抗菌肽溶液（每孔50 μ 1 ;使抗菌肽在孔中的浓度为0. 1、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、4. 0、8. 0 或16. 0 μ g/