一种金枪鱼肝脏抗菌肽及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种金枪鱼肝脏抗菌肽，本发明还涉及该抗菌肽的制备方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 抗菌肽（antibacterial peptide，ABP)是广泛分布于细菌、病毒和各种动植物体 内一类具有抗菌活性的多肽类物质，是生物天然免疫防御系统的重要组成部分。目前，抗菌 肽来源主要有：从生物体中直接提取、化学合成、基因工程和酶解法。食物源蛋白为原料酶 解制备抗菌肽的研究，主要集中在乳源蛋白方面，而以其他食源蛋白为原料，通过酶解方式 获得具有抗菌活性的多肽的研究报道相对较少。
[0004] 金枪鱼是世界远洋渔业的重要作业鱼种之一，据国际粮农组织（FAO)渔业统计年 鉴的数据，近5年大洋金枪鱼世界年产量均在650万吨以上，在金枪鱼加工过程中产生约 占总重量8%的肝脏，未被有效利用，既浪费了海洋资源，也对生态环境产生了巨大压力。基 于此，申请人以金枪鱼肝脏为原料，利用酶解技术制备抗菌肽，既增加了金枪鱼资源的利用 率，也为海洋抗菌药物的开发提供候选药物。
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种金枪鱼肝脏 抗菌肽，该抗菌肽对革兰氏阴性菌（G )和革兰氏阳性菌（G+)均有抑菌作用。
[0007] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种金枪鱼肝脏抗菌肽的制备方法，该 工艺科学合理、易于操作。
[0008] 本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼肝脏抗菌 肽，其特征在于该抗菌肽的氨基酸序列为Thr-Gln-Ala-Ala-Phe-Gln-Lys-Phe-Leu-Ala-V al- Ala-Thr-Ser-Gln-Leu-Gly-Lys-Gln-Tyr-His-Tyr-Trp (TQAAFQKFLAVATSQLGKQYHYff), MALDI-T0F-MS 检测分子量为 2686. 66 Da。
[0009] 本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼肝脏抗菌肽 的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1)金枪鱼肝脏的预处理：金枪鱼肝脏从冰冻金枪鱼中取出后，按照固液比I g :3~5mL 加入沸腾的乙酸溶液（1%)中5~8 min，然后用高速组织捣碎机匀浆。
[0010] 2)金枪鱼肝脏粗蛋白的提取：将匀浆加热至20~30°C，在功率为200~300W，频 率为50~80kHz超声波发生器内超声提取30~45 min，9 000 r/min离心15~25 min， 取上清液，冷冻干燥，得金枪鱼肝脏粗蛋白。
[0011] 3)金枪鱼肝脏粗蛋白的酶解：将金枪鱼肝脏粗蛋白按照固液比I g :3~5mL加入 磷酸盐缓冲液（〇. 02 mol/L，pH 6. 5~7. 5)，按照肝脏粗蛋白质量的1. 5~2. 5%加入蛋白 酶，于温度55~65°C下酶解2~4 h，得酶解产物。
[0012] 4)金枪鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的金枪鱼肝脏粗蛋白酶解产物依次经超滤和 层析，得到金枪鱼肝脏抗菌肽。
[0013] 作为优选，所述步骤3)中的蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力多2. OX IO4 U/g。
[0014] 再改进，所述步骤4)的超滤和层析的具体过程为： 超滤：将金枪鱼肝脏粗蛋白酶解产物采用5 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小 于5 kDa部分，得超滤酶解液； 大孔树脂纯化：将得到的超滤酶解液制成浓度为10~20 mg/mL溶液，以3~5 mL/min 加入到大孔树脂层析柱，然后用60%乙醇进行洗脱，洗脱液于50 °C以下低压旋蒸除去乙醇 后，冷冻干燥得大孔树脂精制多肽。
[0015] 凝胶层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为10~20 mg/mL的溶 液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分， 其中，对大肠杆菌（fecAericAia coJi)和巨大芽抱杆菌抑制率最 高组分为凝胶层析酶解物。
[0016] 高效液相色谱制备：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100 μ g/mL 的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC )进行纯化，根据对大肠杆菌（fccAericAia coJi)和巨大芽孢杆菌（ifeciWiAs 抑制率得1个高活性抗菌肽 TQAAFQKFLAVATSQLGKQYHYW 〇
[0017] 优选，所述大孔树脂为AB-8。再优选，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25 ;所述RP-HPLC 条件为：进样量20~25 μ L ;色谱柱为Zorbax C18;流动相：40%乙腈；洗脱速度0.8~1.0 mL/min ;紫外检测波长215 nm。
[0018] 与现有技术相比，本发明的优点在于： (1)以金枪鱼肝脏为原料，提高了金枪鱼资源的利用率，减少了环境污染。
[0019] (2)制备的抗菌肽（TQAAFQKFLAVATSQLGKQYHYW)对革兰氏阴性菌（G )(大肠杆菌 {Escherichia coif)、1制爲Pseudomonas fluorescens)Pseudomonas aeri/giflasa ))和革兰氏阳性菌（G+)(金黄色葡萄球（ayrei/6·)、巨大芽孢杆 菌（ifeciUiA? _5?6职teri·)、藤黄八叠球菌（知iea))均有抑菌作用。
[0020] (3)以食物源蛋白酶解所得的抗菌肽具有安全性高、来源丰富的优点，应用前景广 阔。
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【附图说明】
[0022] 图1是本发明大孔树脂精制多肽的葡聚糖凝胶G-25层析图； 图2是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物的反相高效液相色谱（RP-HPLC)图。
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【具体实施方式】
[0024] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0025] 一种金枪鱼肝脏抗菌肽的制备方法，制备工艺流程如下：金枪鱼肝脏预处理〃蛋 白抽提〃酶解〃超滤〃大孔树脂精制〃凝胶过滤层析〃高效液相色谱制备〃抗菌肽。
[0026] 实施例： 1)金枪鱼肝脏的预处理：金枪鱼肝脏从冰冻金枪鱼中取出后，按照固液比I g :4mL加 入沸腾的乙酸溶液（1%)中5 min，然后用高速组织捣碎机匀浆。本实施例采用的金枪鱼优 选鲣鱼。
[0027] 2)金枪鱼肝脏粗蛋白的提取：将匀浆加热至25°C，在功率为300W，频率为60kHz 超声波发生器内超声提取45 min，9 000 r/min离心20 min，取上清液，冷冻干燥，得金枪鱼 肝脏粗蛋白； 3) 金枪鱼肝脏粗蛋白的酶解：将金枪鱼肝脏粗蛋白按照固液比I g :4mL加入磷酸盐缓 冲液（0. 02 mol/L，pH7. 0)，按照肝脏粗蛋白质量的2. 5%加入中性蛋白酶，于温度60°C下酶 解3 h，得酶解产物； 4) 金枪鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的金枪鱼肝脏粗蛋白酶解产物依次经超滤和层 析，得到金枪鱼肝脏