一类新颖抗菌肽的制备方法及其抗癌用图
【专利摘要】本发明公开了一类新颖抗菌肽及其制备方法，本发明还披露了其抗癌用途。
【专利说明】
一类新颖抗菌肽的制备方法及其抗癌用途
技术领域
[0001] 本发明属于药学领域，本发明介绍了一类新颖抗菌肽及其制备方法，本发明还揭 示了所述抗菌肽在预防治疗癌症方面的用途。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽(Peptaibols)是一类天然链状寡肽，具有三种典型化学结构特征，包括:含 有高比例的非蛋白质氨基酸残基或脂氨酸，尤其富含α-氨基异丁酸(Aib);具有烷基化的N 末端和羟基化的C末端;具有线性α-螺旋，分子量大多在500~2000D，分子长度在5~20残基 之间。因其具有两亲螺旋结构特征，故能选择性的结合于细胞膜形成跨膜孔道，破坏细胞 膜完整性，造成胞内物质外流而引起细胞死亡（C h u g h J Κ，e t al.Biochem.Sco.Trans.2001;Degenkolb T，et al.Chem.Biodivesity 2007)。抗菌肽具有 多种生物活性，如抗菌、抗病毒、抗线虫、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导植物抗性等多种生物学活 性(Daniel J F，et al.Nat.Prod.Rep.2007)，是一种重要的天然活性成分。
[0003] 绝大多数抗菌肽来自于陆地微生物，主要存在于木霉属真菌中。专利
【发明人】通过 前期研究，首次从深海细菌中发现了一类结构全新的抗菌肽。通过体外抗人肿瘤细胞株活 性筛选，发现其具有显著的肿瘤细胞抑制活性，具有进一步药用研究开发的潜力。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于提供两个全新的抗菌肽。
[0005] 本发明的目的之二在于提供该类抗菌肽的制备方法。
[0006] 本发明的目的之三在于揭示上述新型抗菌肽的抗癌用途。
[0007 ]本发明第一方面提供式I~式II所示化合物：
[0008]
式II
[0009] 本发明第二方面提供上述化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0010] 1)以深海细菌 Microbacterium sediminis sp.nov.YLB_01T 作为工程菌种，经过 液体发酵培养，获得含上述化合物的发酵物；
[0011] 2)将发酵物萃取浓缩，通过硅胶、凝胶、HPLC等色谱手段分离与纯化，从菌株发酵 物浸膏中制备式I、式Π 化合物；
[0012] 本发明第三方面本通过MTT方法评价了上述式I、式II化合物的人肿瘤细胞抑制活 性。实验结果表明式I化合物对Bel-7402、BGC-823和A549三种人肿瘤细胞株具有明显的抑 制作用；式Π 化合物对!1(：1'-8、861-7402、86(：-823^549以及42780五种人肿瘤细胞株具有明 显的抑制作用。
【附图说明】
[0013] 图1:式I化合物的高分辨质谱；
[00M]图2:式I化合物m/z 1166片段的裂解质谱；
[0015]图3:式I化合物m/z 712片段的裂解质谱；
[0016]图4:式II化合物的高分辨质谱；
[0017]图5:式II化合物m/z 1180片段的裂解质谱；
[0018]图6:式II化合物m/z 712片段的裂解质谱； 具体实施方案：
[0019] 根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将更好的理解本专利实质，下述 实施方案仅作示例。
[0020] 实例1:深海细菌Microbacterium sediminis sp.nov.YLB-Ol1^液体发酵培养
[0021 ] 1.菌株背景
[0022] Microbacterium sediminis sp.nov.YLB_01T分离自南印度洋海沟，菌株大小为 0.4-0.7 X 0.8-1.7μηι，最佳生长温度28°C，最佳生长pH值7.0，菌种保藏于中国海洋微生物 菌种保藏中心(MCCC: 1A06153T)。
[0023] 2.液体培养基制作：
[0024] 可溶性淀粉2g，ΚΝ〇3〇 · 1 g，MgS〇4〇 · 05g，K2HPO4O · 05g，FeS〇4〇 · 001 g，Urea 0 · 03g，溶 于80mL去离子水中，调pH值6.8。
[0025] 3.菌株发酵：
[0026] 将Microbacterium sediminis sp.nov.YLB_01T菌种接种于含上述培养基的三角 瓶中，28°C下避光恒温培养12d，摇床转速120r/min，得到发酵产物。
[0027]实例2:化合物的制备
[0028]发酵液40L用乙酸乙酯超声萃取3次，每次1.5h，减压浓缩得粗浸膏(4.2g)。浸膏用 用0DS柱色谱以甲醇/水为流动相（10%~100%，v/v)梯度洗脱，90%洗脱组分（l.lg)经半 制备高效液相色谱以84%甲醇/水为流动相等梯度洗脱，纯化得到式I化合物(23.4mg)和式 II化合物（11.8mg)。
[0029] 表1.式I化合物的1H NMR，13C NMR数据归属 [0030]
[0031]
[0032] AHMA = 3-amin〇-2-hydroxy-3-methylbutanoic acid；
[0033] AE = aminoethanol
[0034] 表2.式II化合物的1H NMR，13C NMR数据归属
[0035]
[0037] 式I、式II化合物的质谱数据参考【附图说明】中的图1~图6。
[0038] 实例3:式I、式II化合物的抗肿瘤活性研究：
[0039] 采用 MTT 法测试了式 I 和式 II 化合物对 HCT-8、Bel-7402、BGC-823、A549&&A2780 五种人肿瘤细胞株的细胞毒性，具体步骤为：
[0040] 1.接种细胞：用含10 %胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000- 10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200yL。
[0041] 2.培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时 间）。
[0042] 3 ·呈色：培养3-5天后，每孔加 MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH = 7 · 4) 20yL ·继续孵 育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清 液。
[0043] 4.每孔加150yL DMS0,振荡lOmin，使结晶物充分融解。
[0044] 5.比色:选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时 间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
[0045]表3.式I、式II化合物的人肿瘤细胞株抑制活性
[0046]
[0047] 实验结果表明：式I、式II化合物具有良好的抗肿瘤活性。
【主权项】
1. 一种式I和式II化合物2. 权利要求1所述的化合物的制备方法，包括下述步骤： 1. W海洋细菌Microbacterium sediminis sp .nov.YLB-OlT为菌种，利用液体发酵培 养，获得含上述化合物的发酵物； 2) 将发酵物通过硅胶、凝胶、高效液相等色谱手段分离与纯化，在同一发酵物中制备上 述化合物。3. 式I和式II所示化合物，其药学上可接受的盐或它们的混合物的用途，用于制备药 物，所述药物用于预防或治疗癌症。
【文档编号】A61P35/00GK105837660SQ201510057977
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年2月3日
【发明人】林文翰, 刘 东, 汤熙翔, 林宏, 邵宗泽
【申请人】北京大学, 中国大洋矿产资源研究开发协会