含抗菌肽Cbf-14的消毒剂及其制备和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及消毒剂研究及其应用技术领域，尤其是提供了一种含有抗菌肽Cbf-14 的消毒剂处方研制及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 消毒剂主要用于杀灭传播媒介中的病原微生物，使其达到无害化要求，将病原微 生物消灭于人体之外，切断传染病的传播途径，达到控制传染病的目的。目前常用的消毒剂 一般都是化学消毒剂，有刺激性气味，腐蚀性强，对呼吸道有刺激，对家具、电器、金属物品 等有损害，还对环境有一定的污染。如果为了减少刺激，降低化学消毒的成分的含量，但是 其对细菌及真菌的杀灭能力会大幅度降低，不能达到消毒剂的国家标准。因此迫切的需要 研发出一种安全、低毒、高效、广谱的新型消毒剂。
[0003] 随着对消毒剂的不断研究，研发出了一系列不同总类的消毒剂，为了针对不同适 应症其制剂种类不断增多。对于主要针对皮肤、黏膜的消毒剂，液体消毒剂相对于其他剂型 的消毒剂更加有优势，因为液体消毒剂对于皮肤的保护作用更强，它能够使得皮肤粗糙度 降低，保持皮肤的水分不丢失，并且对于皮肤的刺激性较低。对剂型的进一步研究发现，喷 雾剂能够将药物喷至腔道黏膜、皮肤上，且携带较为方便且应用范围更加广泛等优点，使其 成为了本发明消毒剂的剂型首选。
[0004] 在我们的前期研究中发现抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs)具有广谱抗菌 的作用，他对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌都有一定的杀菌作用，并且其是人体免疫体系 的一部分，其与吞噬细胞、上皮细胞、干扰素、溶酶体、补体等一样是防御病原微生物入侵的 非特异性屏障。抗菌肽Cbf-14是在金环蛇Cathelicidin抗菌肽BF-30的基础上通过生物 信息学的优化得到了含有14个氨基酸序列的多肽，其氨基酸序列为RLLRKFFRKLKKSV，其带 有7个正电荷，分子量为1819. 33,等电点为12. 31。根据研究发现其对细菌有着很好的杀 菌活性，其对耐药细菌也有着很好的杀菌作用。公开于中国专利CN103435686A中。
【发明内容】
[0005] 本发明公开了一种含有抗菌肽Cbf-14的消毒剂，消毒剂中加入了两性离子表面 活性剂，使得消毒剂能够在更短的时间内达到国标要求的消毒效果，在消毒剂中添加了抗 菌肽保护剂，使消毒剂中的抗菌肽Cbf-14在较长时间内维持在较高浓度，较好的延长了 产品的有效期。
[0006] 本发明还公开了一种含有抗菌肽Cbf-14的消毒喷雾剂的制备方法。
[0007] 优选的本发明的消毒剂，含有下列各比例的组分：
[0008]
[0009] 余量为水。所述百分比为体积百分比。
[0010] 其中聚乙二醇-400为多肽保护剂。丙三醇为多肽保护剂和保湿剂。异构醇聚氧 乙烯醚为两性离子表面活性剂。
[0011] 本发明的消毒剂主要用于手术后创面的消毒处理及手术伤口的护理，外伤创面的 皮肤消毒处理，烧伤、烫伤、灼烧、擦伤的皮肤消毒护理，手术器械的消毒处理，一般性的皮 肤黏膜消毒护理。
[0012] 本发明的消毒制剂优选针对的菌种为革兰阳性菌金黄色葡萄球菌，革兰阴性菌铜 绿假单胞菌和真菌白色念珠菌等菌株。
[0013] 本发明的消毒剂其剂型优选为喷雾剂。
[0014] 本发明的消毒剂可用如下方法制备：称取抗菌多肽Cbf-14,加无菌水一定量搅拌 至溶解，再依次添加PEG400、异构醇聚氧乙烯醚、丙三醇，最后补加无菌水至定容，过滤除 菌，即得。
[0015] 下面是本发明消毒剂处方筛选、活性实验及结果。
[0016] -、消毒剂处方筛选试验：
[0017] (1)PEG400 的配比筛选：
[0018] 在抗菌肽Cbf-14最终浓度为300 y g/mL的情况下调整PEG400的比例，使PEG400 的比例为5 %，10 %，20 %，30 %，40 %。在此条件中，分别测定其对于革兰阳性菌金黄色葡萄 球菌，革兰阴性菌铜绿假单胞菌，真菌白色念珠菌的杀菌效力。
[0019] 结果见图1。从图1我们可以看出PEG400的比例对于消毒剂的杀菌效果并无太大 影响，且从图中我们发现多肽短时间内对白色念珠菌的杀菌效力不能达到国家消毒剂的标 准（即对真菌的杀灭对数值大于4. 00)，因此我们要提高消毒剂对于真菌的杀菌能力并且 对于PEG400的比例也需进一步研究。
[0020] (2)异构醇聚氧乙烯醚的配比筛选：
[0021] 在一系列试验之后我们发现两性离子表面活性剂能够很好的使细菌和真菌的细 胞表面张力降低，能够辅助抗菌肽对于细菌及真菌更好的杀伤。
[0022] 在抗菌肽Cbf-14最终浓度为300 y g/mL的情况下调整异构醇聚氧乙烯醚的比例， 使异构醇聚氧乙烯醚（AE05-80N)的比例为0. 5%，1%，2%，3%，4%，5%，在此条件中，分 别测定其对于金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，白色念珠菌的杀菌效力。
[0023] 结果见图2。从图2中我们可以看出在异构醇聚氧乙烯醚的配比为1%的时即能 有很好的杀菌活性，因此配方中的异构醇聚氧乙烯醚的配比优选1%为下限。
[0024] (3)单纯的异构醇聚氧乙烯醚对于细菌和真菌的杀菌能力
[0025] 在不添加任何抗菌肽Cbf-14的前提下测定不同配比的异构醇聚氧乙烯醚对于细 菌和真菌的杀菌作用。
[0026] 结果见图3。从图3中我们可以发现不同比例的异构醇聚氧乙烯醚（AE05-80N)对 于金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，白色念珠菌这些菌株在5min内并没有杀菌能力，但是 在添加了抗菌肽Cbf-14的条件下消毒剂就能够快速导致细菌与真菌的死亡，这证明在添 加了两性离子表面活性剂能够使得细菌与真菌细胞表面张力下降，从而辅助抗菌肽Cbf-14 对于细菌和真菌的杀伤能力。
[0027] (4)消毒喷雾剂的多肽保护剂及皮肤保湿剂配比最终确定：
[0028] 在本发明的开发过程中我们发现低配比的多元醇对于多肽有更好的保护作用，在 丙三醇含量为2~10 %范围内添加PEG400不同的浓度后，发现PEG400含量为5~20 %时 最适合。表1是在添加了5%丙三醇的基础上添加30%?￡6400、20%?￡6400、15%?￡6400、 10% PEG400和5% PEG400五种配比，将其放置于54°C的培养箱中孵育14天之后观察其中 抗菌肽Cbf-14的含量的变化，选择对抗菌肽有更好保护作用的配比。
[0029] 表1为经过54°C孵育14天不同配比溶液中抗菌肽Cbf-14含量测定
[0030]
[0031] 由表1中我们可以发现抗菌肽Cbf-14的保留时间在9. Smin左右，与Cbf-14标样 的峰面积相比5% PEG400与5%丙三醇组成的配比的峰面积在54°C经过14天之后仍无太 大变化，其中Cbf-14含量下降只有6. 4%，而30% PEG400溶液其含量下降了 60. 3%。 [0032] (5)抗菌肽Cbf-14浓度的筛选
[0033] 在确定最优配比之后。我们调整抗菌肽Cbf-14的浓度，以降低生产成本，更好的 服务于广大消费市场。在溶剂条件一定的情况下调整抗菌肽Cbf-14的质量浓度，使其最终 药物浓度分别为100、150、200、300、400、500 yg/mL，测定其对于金黄色葡萄球菌，铜绿假 单胞菌，白色念珠菌的杀菌效力。
[0034] 结果见图4。从图4中我们可以看出虽然在150 y g/mL消毒剂对于金黄色葡萄球 菌，铜绿假单胞菌都还有不错的杀菌活性但是对于真菌白色念珠菌的杀伤作用不能满足国 家对于消毒剂的标准，所以其优选的最低有效浓度为200 y g/mL。
[0035] 二、过滤冲洗法去除消毒剂残留的试验：
[0036] (1)试验菌与菌液制备：
[0037] 细菌：金黄色葡萄球菌ATCC 6538、铜绿假单胞菌ATCC 15552 ;真菌：白色念珠菌 ATCC 10231
[0038] 将试验用细菌从甘油管中接种至营养琼脂斜面，37°C培养24h，在挑取少量菌落 于2mL的营养肉汤培养基中，37°C培养8h，即得菌悬液；将真菌接种至改良马丁琼脂斜面， 30°C培养48h，挑取少量菌落于2mL改良马丁培养基中，30°C培养8h，即得菌悬液。
[0039] (2)消毒剂制备：
[0040] 称取抗菌肽Cbf-14 200mg于洁净干燥烧杯中，加无菌水300mL，搅拌至溶解，再逐 一添加50mL PEG400, IOmL异构醇聚氧乙稀醚，50mL丙三醇，最后补加无菌水至1L，搅拌均 勾，0. 22 y m滤膜过滤除菌。
[0041] (3)过滤冲洗法去除消毒剂残留实验：
[0042] 第1组。吸取0.5mL试验菌悬液于试管内，加入0.5mL有机干扰物质，混勾后，置 20°〇±1°(：水浴中51^11后，再吸加4.0 1^消毒剂（应先置201€±1°(：中水浴）于试管内， 混勾，作用5min。吸取该最终样液0. 5mL，加于含4. OmL稀释液试管中，混勾。吸取最终样 液LOmL接种于平皿内，做活菌培养计数。第2组。吸取0.5mL试验菌悬液于试管内，加入 0. 5mL有机干扰物质，混匀后，置20°C ± I °C水浴中5min后，再吸加4. OmL消毒剂于试管中， 混匀。作用5min，对其进行去除消毒剂处理，并取最终样液1.0 mL接种于平皿内，做活菌培 养计数（如为滤膜法，可先进行10倍系列稀释，再经过滤冲洗法处理，然后直接将滤膜有菌 面朝上贴于平板表面）。第3组。吸取试验菌悬液l.OmL，置含4.0mL稀释液的试管中，不 加消毒剂，亦不作任何去除处理，进行活菌培养计数，作为阳性对照值。
[0043] (4)评价标准
[0044] 第1组无试验菌，或仅有极少数生长；第2组有远较第1组为多，但较第3组为少 的试验菌生长；第3组测定的结果，微生物数量应在I X IO7~5 X 10 7CFlVmL之间；连续3次 试验取得合格评价。
[0045] (5)实验结果见表2。
[0046] 表2即为膜过滤冲洗法去除残留消毒剂的结果
[0047]
[0048] 由表2可以看出用物理方式（即膜过滤冲洗）能够有效的去除其中的消毒剂残 留，这使得消毒剂的药效评价更加的准确。
[0049] 三、消毒喷雾剂对于细菌及真菌的杀菌作用
[0050] (1)试验菌与菌液制备：
[0051] 细菌：金黄色葡萄球菌ATCC 6538、铜绿假单胞菌ATCC 15552 ;真菌：白色念珠菌 ATCC10231
[0052] 将试验用细菌从丙三醇管中接种至营养琼脂斜面，37°C培养24h，在挑取少量菌落 于2mL的营养肉汤培养基中，37°C培养8h，即得菌悬液；将真菌接种至改良马丁琼脂斜面， 30°C培养48h，挑取少量菌落于2mL改良马丁培养基中，30°C培养8h，即得菌悬液。
[0053] (2)消毒喷雾剂对于细菌及真菌的杀灭试验
[0054] 试验组：取消毒试验用无菌试管，先加入0. 5mL试验用菌悬液，再加入0. 5mL有 机干扰物质，混匀，置20 °C ± TC水浴中5min后，用无菌吸管吸取消毒液5. OmL注入其中， 迅速混匀并立即计时；待试验菌与消毒剂相互作用5min，分别吸取1.0 mL试验菌与消毒剂 混合液