一种芝麻抗菌肽制备方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于天然植物成分提取技术领域，涉及一种芝麻抗菌肽制备方法，特别是 一种以芝麻柏为原料经过科学工艺提取抗菌肽的技术方案。
【背景技术】：
[0002] 抗菌肽的别名为宿主防御肽，是由基因编码的，存在于所有生物有机体中的一类 先天免疫分子，是广泛存在于细菌、植物、软体动物、两栖动物、鱼类、鸟类和哺乳动物体内 的一类小分子多肽，由20~60个氨基酸残基组成，具有广谱杀菌作用。与传统抗生素相 比，抗菌肽具有明显的优点：一是不仅能杀灭细菌、真菌和病毒，而且对癌细胞也有一定的 杀伤力；二是有很多的作用靶点，更有利于发挥效应；三是半衰期很短，且耐药性很强；四 是可独立发挥作用，也可与其他因子一起协同作用。因此，抗菌肽作为一类抗菌能力强、抗 菌谱广、种类多、可供选择的范围广的活性肽，在食品添加剂、生物饲料添加剂、医药等领域 都有极其广阔的发展前景。
[0003]目前抗菌肽的生产制备方法和途径主要有三种：一是提取分离自然界生物体中 本身所固有的各种天然抗菌肽类；二是通过水解蛋白质获得具有抗菌功能的活性肽，主要 有酸水解法、碱水解法和酶水解法以及微生物发酵法；三是合成法制备生物活性肽，包括化 学合成法、酶合成法和重组DNA技术合成法。由于抗菌肽在生物体内含量极微，从生物体内 提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产；化学合成法是将带 有氨基保护基的氨基酸的羧基端固定在水不溶性载体上，脱去该氨基酸上的氨基保护基， 同下一个氨基酸的活化羧基缩合形成酰胺键，从而延长肽链形成多肽，但这类方法耗时大、 副反应多且合成试剂毒性大，制约了产品的进一步应用；随着近几年生物技术的发展，重组 DNA技术合成法取得了一定的成就，但通过基因工程的方法获得抗菌肽目前处于瓶颈状态， 而人工合成抗菌肽成本高，且效果不及天然的抗菌肽，在临床上的应用受到限制；酸碱法水 解蛋白存在产生有毒物质、化学污染等缺点。在现有技术的提取方法中，酶水解法和微生物 发酵法由于水解温和且没有有机溶剂及有毒的化学品的残留已成为制备抗菌肽的最有应 用前景的方法，这两种方法的原理均是采用蛋白酶将蛋白水解小分子的肽，酶水解法是在 蛋白中直接加入商业用酶进行水解，微生物发酵法是利用微生物发酵生成的酶进行蛋白质 的水解；虽然较酶水解法而言，发酵法可利用微生物发酵直接生产抗菌肽，减少了蛋白酶的 纯化和制备过程，具有生产周期短、生产成本低的优势，但由于安全性问题，被FDA批准可 用于食品开发的蛋白酶生产菌种是有限的，主要有米曲霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌等，在一 定程度上限制了它的快速发展和应用；因此，酶水解法是目前制备抗菌肽最受推崇的方法。
[0004] 芝麻（SesamumindicmL.)属胡麻科胡麻属，是一种重要的油料种子作物，芝麻 主要生长在热带地区，以及在北炜40°N和40°S之间的温带地区。在亚洲和非洲已种 植了几个世纪。据统计，全世界芝麻产量是400万吨，其中亚洲占250万吨，非洲占13万 吨，分别占全球总产量的60%和33%。芝麻在我国也被广泛种植，是我国四大油料作物之 一，除直接食用外，芝麻大部分都用来榨油，榨油后副产物芝麻渣或饼柏中的蛋白质含量 为38 %~50 %，是生物活性肽的良好来源；而芝麻饼柏主要当做饲料和肥料使用，我国每 年约有50万吨的芝麻柏没有得到很好的利用，极大浪费了这一蛋白资源。因此，国内外多 位学者对酶法制备芝麻活性肽进行了研究，如董英、KAKALI等用碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶 水解芝麻柏蛋白得到的芝麻肽具有抗氧化活性，日本科学家从芝麻蛋白的酶解产物中发现 了降血压肽，并制成"芝麻多肽KM- 20"产品正式上市销售，而关于芝麻抗菌肽的研究，国 内外未见报道。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种芝麻抗菌肽制备方 法，以芝麻饼柏蛋白为原料，选取双酶复合分步酶解技术水解芝麻饼柏蛋白，再经膜分离 技术纯化制备芝麻抗菌肽，为芝麻饼柏的深加工开辟新途径，填补芝麻抑菌肽制备技术空 白，不但使芝麻这一植物资源得到充分的综合利用，而且为人类提供更好的功能性食品和 药品，创造良好的经济效益和社会效益。为了实现上述发明目的，本方法的具体工艺步骤包 括：
[0006] (1)脱余脂：将榨取油脂后的干品芝麻柏以固液比为1:3的重量比例加入乙酸乙 酯，在控温30~40°C条件下加热搅拌30~40mim后过滤，再在滤渣中以固液比1 :2的重量 比例加入重量百分比浓度为95%食用乙醇并在30~40°C控温条件下，继续加热搅拌30~ 40mim后过滤，收集滤渣即为脱余脂的芝麻柏，晾干或30~40°C下烘干备用；
[0007] (2)提取芝麻蛋白：将步骤（1)的滤渣干品中以固液比1 :5的重量比例加入 10 5mol/L氢氧化钠溶液，在30~40°C下加热搅拌50~60mim进行提取后过滤，将滤渣 重复上述步骤再进行提取两次，将三次提取液合并；用重量百分比浓度为〇. 01 %的盐酸 水溶液将提取液的PH调整到4. 5,静置10小时后过滤，收集固体物并控温为40°C，压力 为-0. 07~-0. 09Mpa真空度条件下干燥为固体，S卩为芝麻蛋白固体；
[0008] (3)分步复合酶解：将步骤（2)中的芝麻蛋白固体配成50g/L的水溶液，再加入 13000~14000U/g蛋白的中性蛋白酶，在温度为60~70°C条件下酶解2h;随后用重量百 分比浓度为0. 01 %的盐酸水溶液调整溶液的pH为4,再加入6000~7000U/g蛋白的胃蛋 白酶，在55~60°C下酶解2h，然后将溶液的温度升高到85~95°C保持5min得到酶解液， 离心取上清液；；
[0009] (4)膜分离：将步骤（3)的酶解上清液采用截留相对分子量1000 Da的聚醚砜分离 膜进行过滤分离，温度控制在30~40°C，压力控制为0. 30~0. 35MPa，流速为150~300ml/ min，膜面积为50cm2,收集截留液；再将截留液采用截留相对分子量为2000Da的聚醚砜分 离膜进行膜分离，控制压力为〇. 20~0. 25MPa，流速控制在200~400ml/min，控制温度在 30~40 °C，收集透过液；
[0010] (5)喷雾干燥：将步骤（4)中膜分离的透过液，设定进口温度为130~150°C，出风 温度为80~90°C，空压机压力为0. 2~0. 3Mpa，在常规设计中进行喷雾干燥，得到芝麻抗 菌肽。
[0011] 本发明制备的芝麻抗菌肽产品的抗菌肽含量大于98% ;应用于食品和动物饲料的 产品加工之添加原料；在肉制品加工过程中添加总重量为0. 1~0. 5%的剂量的抗菌肽， 不仅能够控制细菌的生长，保持良好的风味和色泽，还能够降低其中亚硝酸盐的含量，减 少产生危害人们健康的亚硝胺。
[0012] 本发明与现有技术相比，其工艺路线设计合理，工艺条件简单易控，制备操作安全 可靠，产品出率高，质量好，应用范围广，使用环境友好。
【附图说明】：
[0013] 图1为本发明的具体实施工艺流程示意框图。
[0014] 图2为本发明产品抑制金黄色葡萄球菌实验结果示意图，其中，1为pH7缓冲溶 液；2为5g/L芝麻蛋白对照溶液；3为复合酶对照溶液；4、5为10g/L芝麻肽测试溶液；6、7 为25g/L芝麻肽测试溶液。
【具体实施方式】：
[0015] 下面通过实施例并结合附图作进一步说明。
[0016] 实施例1 :芝麻抑菌肽制备
[0017] (1)脱余脂：将榨取油脂后的干品芝麻柏1000 g加入3000g乙酸乙酯，在控温30~ 40°C条件下加热搅拌30~40mim后过滤，再在滤渣中加入重量百分比浓度为95%食用乙 醇2000g，并在30~40°C控温条件下，继续加热搅拌30~40mim后过滤，收集滤渣即为脱 余脂的芝麻柏，晾干或30~40 °C下烘干备用，称取其重量为978. 5g;
[0018] (2)提取芝麻蛋白：将步骤⑴的滤渣干品中以固液比I:5的重量比例加入 10 5mol/L氢氧化钠溶液，在30~40°C下加热搅拌50~60mim进行提取后过滤，将滤 渣重复上述步骤再进行提取两次，将三次提取液合并；用重量百分比浓度为0. 01 %的盐 酸溶液将提取液的PH调整到4. 5,静置10小时后过滤，收集固体物并控温为40°C，压力 为-0. 07~-0. 09Mpa真空度条件下干燥为固体，S卩为芝麻蛋白固体，称重为359. 0g，测定其 蛋白含量为85. 18% ;
[0019] (3)分步复合酶解：将步骤（2)中的芝麻蛋白固体配成50g/L的水溶液共7. 18L， 按照13500U/g蛋白的比例加入中性蛋白酶（酶活为4.9X104U/g)99g，在温度为60~ 70°C条件下酶解2h;随后用重量百分比浓度为0. 01 %的盐酸溶液调整溶液的pH为4,按照 6500U/g蛋白的比例再加入胃蛋白酶（酶活为I. 3X104U/g) 179. 5g，在55~60°C下酶解 2h，然后将溶液的温度升高到85~95°C保持5min得到酶解液，离心取上清液；
[0020] (4)膜分离：将步骤（3)的酶解上清液采用截留相对分子量1000 Da的聚醚砜分离 膜进行过滤分离，温度控制在30~40°C，压力控制为0. 30~0. 35MPa，流速为150~300ml/ min，膜面积为50cm2,收集截留液；再将截留液采用截留相对分子量为2000Da的聚醚砜分 离膜进行膜分离，控制压力为〇. 20~0. 25MPa，流速控制在200~400ml/min，控制温度在 30~40 °C，收集透过液；
[0021] (5)喷雾干燥：将步骤（4)中膜分离的透过液