一种抗菌肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及一种抗菌肤及其应用。
【背景技术】
[0002] 近年来由于传统抗生素的滥用导致越来越严重的病原微生物的耐药性问题，给人 类的健康带来巨大威胁，迫切需要开发新的抗菌药物。为了解决运个问题，抗菌肤受到了越 来越多的关注。抗菌肤是生物体在抵御外来病原微生物入侵时产生的一种有活性的多肤物 质，是生物体先天性免疫应答的重要组成部分。一般由20-60个氨基酸组成，分子量40kDa 左右。至今为止，已经在动物，植物，微生物和人的体内发现了超过1500种抗菌肤，抗菌肤 具有分子量低，抗菌谱广，不易产生耐药性的优点。
[0003] 然而，天然的抗菌肤部分存在免疫原性、抗菌活性低，稳定性差，细胞毒性强，溶血 率高等问题，限制了其作为抗菌药物的推广应用。因此，寻找抗菌活性强、安全性高、稳定性 好的抗菌肤是实现抗菌肤部分替代抗生素的关键因素。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种抗菌肤，其分子量小，稳定性好，细胞毒性小，溶血活性 低，抗菌活性强。 阳〇化]本发明的另一目的是提供上述抗菌肤的应用。
[0006] 为了实现上述目的，本发明的抗菌肤，该抗菌肤具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序 列：AsnTrpPheAlaIleThrAsnTrpLeuTrpTyrIleLysLysLysLys。
[0007] 所述抗菌肤的分子量为2181. 63D，等电点为9. 87。
[0008] 上述抗菌肤在制备治疗革兰氏阴性菌或者革兰氏阳性菌感染的广谱抗菌药物中 的应用。
[0009] 上述抗菌肤在制备抗菌剂中的应用。
[0010] 本发明的抗菌肤不但对大肠杆菌、枯草杆菌和表皮葡萄球菌等革兰氏阴性菌和阳 性菌都有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性和细胞毒性，稳定性好，抗菌活性强， 具有高效广谱抑菌作用，可作为抗生素替代品使用。
【附图说明】 W11] 图1为抗菌肤AP16-A的质谱图；
[0012] 图2为抗菌肤AP16-A和蜂毒肤对大肠杆菌的抑菌曲线图；
[0013] 图3为抗菌肤AP16-A和蜂毒肤对枯草杆菌的抑菌曲线图；
[0014] 图4为抗菌肤AP16-A和蜂毒肤对表皮葡萄球菌的抑菌曲线图；
[0015] 图5为抗菌肤AP16-A和蜂毒肤的溶血活性测定结果图；
[0016] 图6为抗菌肤AP16-A和蜂毒肤的MT法细胞毒性测定结果图； 阳017] 图7为抗菌肤AP16-A的小鼠急性毒性试验测定结果图； 阳01引图8为抗菌肤AP16-A的小鼠急性毒性试验体重变化图；
[0019] 图9为抗菌肤AP16-A37°C热处理后的HPLC图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。 阳02UHIV-I的胞外近膜区域（Ac-665WASLWNWNITNWLWYIK683-NHz)具有膜活化的特性并 且此区域包含HIV-I的广谱中和抗体4E10和2巧表位。根据抗菌肤的作用机理和氨基酸 组成的特点，本发明在4E10表位的基础上在其C-末端添加一个含=个赖氨酸的水溶性尾 己，W增加多肤的正电性和水溶性，并在此基础上进行一系列的多肤改造。本实施方式中共 有屯个抗菌肤，其一级机构和分子量如表1所示，其一级结构的氨基酸序列如表2所示。
[0022] 表1抗菌肤的一级结构和分子量
[0024] 表2抗菌肤一级结构的氨基酸序列
[0027] 本实施例中设及的抗菌肤均委托杭州中肤有限公司合成，设及的大肠杆菌购自 Takara,枯草杆菌和表皮葡萄球菌购自ATCC(美国模式菌种收集中屯、），设及到其他化学试 剂及药品均通过商业途径获得。
[00測 （1)多肤AP16及其衍生物的抗菌实验
[0029] A.最小杀菌浓度（MBC)的测定
[0030] 分别将革兰氏阴性菌株大肠杆菌巧.coli D册a)、革兰氏阳性菌株枯草杆菌 度.subtilisATCC6633)和表皮葡萄球菌仅epidermidisATCC12228)培养至对数生长 期，500化pm离屯、10分钟后用憐酸钟缓冲液重悬，再次离屯、，500化pm离屯、10分钟，用憐酸 钟缓冲液重悬，将菌株稀释至1X1〇6-2Xl〇6CRJ/ml，待用。在96孔板内，分别将多肤P16 及其衍生物用憐酸钟缓冲液按1:2逐级稀释，浓度为256yg/ml-1yg/ml，每孔100y1，再 每孔加入100y1稀释好的W上=种菌株之一，空白孔内加入100y1的憐酸钟缓冲液和 IOOiil已准备好的菌株，同时每个多肤浓度做两个复孔，37°C静止培养化。将每孔内的液 体吹匀，同一多肤浓度的两个孔内的液体加入到一个新的EP管内，混匀后取出100y1涂平 板，37°C倒置过液培养。第二天查菌斑数并记录，完全没有菌斑的平板对应的最小多肤浓度 为最小杀菌浓度。
[0031] 表3中用最小杀菌浓度值（MBC)表征抗菌肤的抑菌能力，MBC值愈小则说明抑菌能 力愈强。由表3可W看出，AP16-A的抑菌活性最好，最小杀菌浓度在2-16yg/ml之间。后 续研究选取AP16-A作为主要的研究对象，将多肤AP16-A经过电喷雾质谱法分析，在质谱图 (图1)中显示的分子量2181. 63D与理论分子量2181.抓基本一致，多肤AP16-A的等电点 为9. 87,多肤AP16-A的纯度大于98 %。
[0032] 表3多肤AP16及其衍生物的最小杀菌浓度
[0034]B.抑菌活性的测定 W35] 将革兰氏阴性菌株大肠杆菌化COliD册a)、革兰氏阳性菌株枯草杆菌 度.subtilisATCC6633)和表皮葡萄球菌仅epidermidisATCC12228)培养至对数生长 期，500化pm离屯、10分钟后用憐酸钟缓冲液重悬，再次离屯、，500化pm离屯、10分钟，用憐酸 钟缓冲液重悬，将菌株稀释至1X1〇6-2Xl〇6CFU/ml，待用。在96孔板内，将多肤AP16-A用憐 酸钟缓冲液按1:2逐级稀释，浓度为256yg/ml-1yg/ml，每孔100y1，再每孔加入100y1 稀释好的^上立种菌株之一，空白孔内加入IOOy1的憐酸钟缓冲液和IOOy1的已准备好 的菌株，同时每个多肤浓度做两个复孔，37°C静止培养化。将每孔内的液体吹匀，同一多肤 浓度的两个孔内的液体加入到一个新的EP管内，混匀后取出100y1到装有900y1液体LB 培养基的EP管内，按1:10逐级稀释至1:103,每个稀释度各取出100y1涂平板，37°C倒置 过液培养。第二天查菌斑数并记录，每个平板上的菌斑数乘W10再乘W稀释倍数为抗菌肤 作用后每毫升内未被杀死的细菌数量。
[0036] 测定结果如图2-4所示，多肤浓度为1/2最小杀菌浓度时，使得超过99 %的大肠杆 菌和表皮葡萄球死亡，超过99. 99 %的枯草杆菌死亡，在1/4最小杀菌浓度时，超过99 %的 枯草杆菌死亡。
[0037] 似细胞毒性研究
[0038] 抗菌肤的研究面临的很重要的问题就是对宿主细胞的毒性，抗菌肤必须能够区 分哺乳动物细胞和细菌细胞。
[0039]A.溶血活性实验
[0040] 新鲜的豚鼠红细胞用生理盐水洗2次，300化pm，离屯、30分钟，4%重悬到生理盐水 中。在96孔板内按1:2将多肤AP16-A进行逐级稀释，蜂毒肤作为对照组。每孔lOOiil， 再每孔加入100y1豚鼠红细胞，37°C培养比。3000巧m，离屯、30min，转移150ul上清至新 的96孔板内，450皿测OD值。用生理盐水和1 %化itonX-IOO作为阴性和阳性对照，1 % TritonX-IOO能够使豚鼠红细胞全部溶血。溶血百分比计算如下： 阳〇川溶血百分比％=[(OD多肤-OD生理盐水）/(OD Triton-OD生理盐水）]X 100%
[0042] 检测结果如图5所示。
[0043] 蜂毒肤是由26个氨基酸残基组成的多肤，分子量2840,其一级结构的氨基酸序列 沈Q NO:8为：Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Tyr Tyr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln〇
[0044] 同天然存在的抗菌肤蜂毒肤相比，在最小杀菌浓度时AP16-A几乎没有溶血活性， 然而蜂毒肤几乎造成超过72%的豚鼠红细胞溶血。 W45]B.MTT测定细胞毒性
[0046]hCMEC/D3细胞（IXIO4)接种于96孔板内，每孔IOOii1，过夜培养至汇合率达 到80 %。多肤1:2逐级稀释后加入细胞培养液中，每孔IOOii1，培养化，阴性对照孔内 加入IOOyl的细胞和IOOyl的空的RPMI-1640培养基。5mg/ml的3-(4,5-二甲基嚷 挫-2)-2, 5-二苯基四氮挫漠盐（MTT)溶液20y1加入到细胞培养液中，避光解育2小时。 弃去培养基，甲臘晶体用150y1二甲亚讽值MS0)溶液溶解，检测490皿处光密度（OD)。测 定结果如图6所示，同蜂毒肤相比较，AP16-A随着浓度的增加没有表现出细胞毒性。
[0047] C.小鼠体内毒性检测（极性毒性试验）
[0048] 4-6周龄，18-20g的BALB/c雌鼠，随机分组，每组六只，腹腔注射200mg和400mg 多肤AP16-A，空白对照组注射等体积的生理盐水。记录屯天内的死亡率和体重变化。由图 7可知，屯天内没有小鼠死亡，且由图8可看出，同对照组相比，体重也没有明显的变化。 W例 做热稳定性检测 阳化0] 用水将多肤溶解，分装于不同的EP管中，放于37 °C，Oh,化，6h，12h，2地，2d，3d， 9d，15d分别收集样品放于-80°C保存。将样品进行HPLC和抑菌试验检测。由表4可知，AP16-A经过在37°C下15天的处理后没有明显的降解，抑菌浓度和未经37°C处理的样品一 致。由图9所示，从HPLC的检测结果可W看出经过15d的37°C的处理，没有明显的杂峰出 现。 阳〇5U 表4抗菌肤AP16-A37°C下不同时间的热稳定性检测
【主权项】
1. 一种抗菌肽，其特征在于，该抗菌肽具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列：AsnTrp PheAlalieThrAsnTrpLeuTrpTyrlieLysLysLysLys〇2. 如权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的分子量为2181. 63D，等电点 为 9.87〇3. 如权利要求1所述的抗菌肽在制备治疗革兰氏阴性菌或者革兰氏阳性菌感染的广 谱抗菌药物中的应用。4. 如权利要求1所述的抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种抗菌肽，属于分子生物学领域。该抗菌肽具有如SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列：Asn？Trp？Phe？Ala？Ile？Thr？Asn？Trp？Leu？Trp？Tyr？Ile？Lys？Lys？Lys？Lys。本发明的抗菌肽不但对大肠杆菌、枯草杆菌和表皮葡萄球菌等革兰氏阴性菌和阳性菌都有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性和细胞毒性，稳定性好，抗菌活性强，具有高效广谱抑菌作用，可作为抗生素替代品使用。
【IPC分类】A61K38/10, C07K7/08, A61P31/04
【公开号】CN105294838
【申请号】CN201510608404
【发明人】单亚明, 贺晓秋
【申请人】徐州市玛泰生物科技有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年9月22日