抗菌肽mp1106、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种基于Plectasin而设计的新型抗菌肽MP1106(Seq ID No.1)，并提供其在毕赤酵母中高效表达的方法。通过酵母密码子的偏好性优化抗菌肽MP1106编码基因，构建重组质粒后转入毕赤酵母中，实现5L发酵罐高密度发酵蛋白的分泌表达(总蛋白水平达2.134g/L)，纯化后重组MP1106产量达到831mg/L。此外，建立了重组MP1106阳离子交换层析一步纯化法，对新型抗菌肽MP1106体外性质研究表明，它具有较强抗金黄色葡萄球菌活性，无细胞毒性，在高温、碱性环境、血清孵育条件下稳定，对木瓜蛋白酶，胃蛋白酶等有抗性。新型的抗菌肽MP1106性质优良，可以实现大规模产业化生产，具有开发成新型抗金黄色葡萄球菌制剂的潜能。
【专利说明】抗菌肽MP1106、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种新型的抗菌肽 MP1106、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌是人类和畜牧业感染中最常见的病原菌之一。它可以感染皮肤 和软组织，引起肺炎、感染性心内膜炎等局部感染，及引起菌血症、败血症等全身性感染， 可造成严重的临床疾病（Chambers and Deleo 2009, Nickerson, West et al. 2009)，且金 黄色葡萄球菌易产生耐药性，甚至出现多重耐药菌株变异，导致其越来越难于防治（Lowy 1998)。甲氧西林在1960年引入临床使用两年后就出现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA) (Graveland，Duim et al.2011)。近些年，不仅在医院（医院获得MRSA，HA-MRSA)，社区 (社区获得MRSA，CA-MRSA)发现MRSA，还在畜禽身上（畜禽获得MRSA，LA-MRSA)发现 MRSA (Chambers and Deleo 2009, Kock，Mellmann et al. 2011)。并且，2003 年首次报道了 在人身上发现动物源]?1?4卜&11(：1661]\1〇111^^6丨31.2〇11)。此外，]\--4对0-内酰胺类 的抗生素，包括盘尼西林、头孢菌素类、碳青霉烯类等抗生素都有耐药性，一些MRSA对其他 常见的抗生素均具有耐药性（Lowy 1998, Diekema，Pfaller et al· 2001，Antti，Fahlgren et al. 2013)。因此，急需寻找新的抗菌药物来防治越来越严重的耐药性金黄色葡萄球菌。
[0003] Plectasin是Mygind等首次从腐生子囊菌中分离出来的首例真菌防御素，具有抗 革兰氏阳性菌的活性（Mygind，Fischer et al. 2005)，由40个氨基酸组成，包含6个半胱 氨酸，三级结构包含一个N端的α-螺旋，C端的两个反向平行β-折叠结构以及螺旋和 折叠结构之间的Loop区组成，6个半胱氨酸形成3对二硫键（Cys4_Cys30、Cysl5_Cys37、 Cysl9_Cys39)稳定空间构象（Mygind, Fischer et al· 2005,Mandal，Pentelute et al. 2009)。Plectasin是通过与细菌细胞壁的合成前体Lipid II结合阻碍细胞壁合成而 发挥杀菌作用的（Schneider, Kruse et al. 2010)。已有实验研究表明Plectasin对哺乳 动物细胞没有毒性，且不引起细胞因子的产生（Hara，Mukae et al.2008)，免疫学实验表 明，Plectasin 不引起特异性的抗体产生（Brinch, Frimodt-Moller et al. 2009)。近年 来，还有研究表明Plectasin可成为潜在的抗登革热病毒的候选药物（Rothan，Mohamed et al. 2013)。但是Plectasin对肺炎链球菌和表皮葡萄球菌的活性（MIC :0. 063-8 μ g/ml和 4-32 μ g/ml)强于其对金黄色葡萄球菌的活性（MIC :4-128 μ g/ml) (Mygind, Fischer et al· 2005, Hara，Mukae et al· 2008)。
[0004] 一些天然的抗菌肽由于其杀菌活性不强，稳定性不高，细胞毒性大，不易实现 大规模生产，生产成本高等因素一直制约着抗菌肽的进一步利用（Findlay, Zhanel et al. 2010, Nicole K.Brogden and Brogden 2011)。已有很多研究对天然抗菌肽序列进行 了修饰和优化，获得了杀菌活性强，毒性低的新型抗菌肽，为抗菌肽的进一步应用提供借鉴 (Hilpert, Elliott et al. 2006, Lee, Park et al. 2014) 〇
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种新型的抗菌肽MP1106、其制备方法及应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供一种新型的抗菌肽MP1106,其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示。它是基于Plectasin而设计的强抗金黄色葡萄球菌的衍生肽，新型的衍生肽 MP1106的设计，在母体肽Plectasin序列上突变了四个位点（D9S、D11K、Q14H和V36I)，生 物信息学工具分析理化参数，抗菌活性评分等见表1。
[0007] 表 lPlectasin 及 MP1106 的理化参数
[0008]
【权利要求】
1. 抗菌肽MP1106,其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示。
2. 编码权利要求1所述抗菌肽MP1106的基因，其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
3. 含有抗菌肽MP1106编码基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括诱导型启 动子、位于启动子下游的编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列以及编码权利要求1所述 抗菌肽ΜΡ1106的DNA序列。
4. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，出发载体为pPICZ α Α。
5. 根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，抗菌肽ΜΡ1106编码基因的表达框位 于载体的多克隆位点区的Xho I和Xba I两个限制性酶切位点之间，在Xho I酶切位点 下游是Kex2基因表达产物切割识别序列AAGAGA，在Kex2切割位点后依次为诱导型启动子、 位于启动子下游的编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列以及如Seq ID No. 2所示的编码 抗菌肽MP1106的DNA序列，后面连接两个终止密码子，另外，在Xho I和Xba I两个酶切 位点外侧还设有酶切位点保护碱基。
6. 含有权利要求3-5任一项所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为 毕赤酵母。
7. 根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母X-33。
8. 权利要求7所述宿主细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)种 子液的制备；2)种子液接种和菌体生长阶段；3)补加葡萄糖菌体生长阶段；4)甲醇诱导阶 段。
9. 一种在重组毕赤酵母中表达抗菌肽MP1106的方法，其是利用权利要求3-5任一项所 述表达载体转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生抗菌肽MP1106。
10. 权利要求1所述抗菌肽MP1106在抗金黄色葡萄球菌中的应用。
【文档编号】C07K14/37GK104250293SQ201410419231
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】王建华, 曹鑫涛, 张勇, 滕达, 王秀敏, 毛若雨 申请人:中国农业科学院饲料研究所