专利名称：：黄鳝抗菌肽的制备工艺及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种从动物中提取抗菌肽的方法，特别是一种黄鳝抗菌肽的制备工艺。本发明还涉及该制备工艺所得产物的用途。
背景技术：
：抗菌肽(Antimicrobialpeptides，AMPs)，也称为肽类抗生素(Peptedeantibiotics),是抗菌活性短肽的总称，具有抗菌力强、抗菌谱广、活性稳定、可以中和细菌内毒素、很难产生耐药性等特点。其研究始于在惜古比天蚕蛹产生的抗菌活性多肽物质既天蚕素(Cecr;^w)，随后人们在动物、植物和微生物中相继发现并分离获得了具有类似性质的活性多肽。水产动物的抗菌肽研究始于1988年，日本学者Nakamura等从亚洲鲎(rac/i^/ewWW&"tort")用酸提取法纯化出鲎素(rac/^pk^)。后来在贝类、鱼类中均有报到。但黄鳝抗菌肽至今尚未见报到。黄鳝，学名^fo"qpfen^a/6w，是我国主要经济水产品之一，营养成分丰富，具有"小暑黄鳝赛人参"之美誉，然而它生存于泥泞污沟却不会发病，黄鳝养殖中也很少有发病的报到，说明其自身能够产生抵御外源病菌的物质，故本研究拟探讨从黄鳝中分离纯化抗菌肽的工艺流程，并分离纯化黄鳝抗菌肽，进而开发利用黄鳝抗菌肽。
发明内容本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的、具有抑菌活性的黄鳝抗菌肽的制备工艺。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种黄鳝抗菌肽的制备工艺，其特点是，其步骤如下(1)黏液制备黄鳝放入水中排除体内杂物后，将黄鳝分别置于标本缸中，撒适量氯化钠于黄鳝体表刺激黄鳝蠕动，收集黄鳝皮肤黏液；(2)上清液制备将黄鳝皮肤黏液于4°C、12000rpm高速冷冻离心20min，取上清液，然后将上清液以厚度不超过2mm分装于若干培养皿中，再用保鲜膜封盖，-401:冷冻保存备用；(3)干粉制备取-40。C冷冻保存24h以上的上述培养皿，在封盖保鲜膜上扎若干个孔，即时用真空冷冻干燥机对其进行冷冻干燥浓縮，获黄鳝皮肤黏液的干粉；(4)一次筛选称取干粉5-10g，5-10mLPBS缓冲液溶解，-4"离心15min，取上清液为样品；测定样品A，；然后选用2.6cmX100cm层析柱，SephadexG-50填料，pH6.0、0.1mol/LPBS洗脱液，按常规方法用SephadexG-50装柱后，以6s—滴的速度平衡柱子24h，将总OD为200-300的样品滴加至SephadexG-50凝胶柱表面，让样品自然或6s—滴的速度流入SephadexG-50凝胶柱中；安装好层析系统，以10s—滴的速度洗脱，自动收集器收集，得每管3mL的按序编号的收集管若干;测定各收集管中A，和A220，以收集管序号为横坐标、A湖和A22o为纵坐标，制作分离图谱，获得4个分离峰，分别命名为MAS-I、MAS-II、MAS-III和MAS-IV;(见图1);(5)二次筛选采用抑菌圈法进行抑菌实验筛选；实验用指示菌为嗜水气单胞菌(jera"。"ay孙(ira/m7(3)、禾古草芽孢杆菌(5acz7/uss"6"fc)、白色念珠菌(Ca"c/油a/6z'c<ms)、大肠杆菌(^Esc/zer/c//aco//)、金黄色葡萄球菌(Sto//^/ococcwflwrew力、鳗弧菌(F6n'ofl"gwz7arww)禾口鲁克氏耳卩尔森菌reefer);将上述7种菌种制备成A6(M)=0.06的菌悬液，取100|aL涂布于LB培养基上，用微量移液器取20^L分离液浸润滤纸，将滤纸片放于涂布菌悬液的培养基上；筛选得到对大肠杆菌、嗜水气单胞菌，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有抑菌效果的MAS-IV;(6)MAS-IV溶液透析:12000r/min,4。C离心MAS-IV5min，取出上清液，放入透析袋(截留分子量3500)中，用Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH7.8)透析2-4h，中间更换缓冲液l-2次；(7)MAS-IV离子交换层析选用12mmX200mm(实装160mm)层析柱，DEAESepharoseFastFlow填料，BiologicDuoflow蛋白质层析系统，利用含0.8mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH7.8)进行梯度洗脱，NaCl浓度从0%-100%，洗脱5个柱体积(108mL)，流速l.OOmL/min;根据BiologicDuoflow蛋白质层析系统配套软件显示的分离峰，分别收集7个分离峰，并依次命名为MAS-IV-1，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV國7;(8)MAS-IV离子交换层析产物的浓縮将MAS-IV-1，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV-7分别分装于培养皿中，厚度不超过2mm，并用保鲜膜封盖，置-40"冰箱冷冻；24h后取出培养皿，在封盖保鲜膜上扎孔，即时用真空冷冻干燥机对其进行冷冻干燥浓縮，获各分离峰干粉；(9)三次筛选采用步骤(5)中所述的方法进行再一次的筛选用抑菌实验;用适量无菌水溶解上述各分离峰干粉制成样品液；筛选得到MAS-IV-3、MAS-IV-4对嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌活性；最终得到目标产物MAS-IV-3、MAS-IV-4黄鳝抗菌肽。本发明以黄鳝为研究对象，制备其皮肤黏液，经SephadexG-50和DEAESepharoseFastFlow等生物化学分离纯化技术获得具有抗菌活性的多肽或蛋白，用抑菌圈法检测抑菌活性。黄鳝皮肤黏液经一次筛选所得到的MAS-I、MAS-II、MAS-III和MAS-IV,抗菌实验结果结果显示对其中五种菌有抑菌效果。参照图2-6可知MAS-I、MAS-II、MAS-III、MAS-IV都或多或少的对一种或几种菌有抑菌效果。对MAS-I、MAS-II、MAS-III和MAS-IV的抑菌效果进行对比，可以看出MAS-IV对图中五种菌都有抑菌效果。所以对MAS-IV进一步分离筛选。将MAS-W经DEAESepharoseFastFlow离子交换层析分离结果如图7。共收集7个峰，命名为MAS-IV-l，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV曙5、MAS-IV-6和MAS-IV-7，为简便起见，图中分别标注为1、2、3、4、5、6、7。在本发明中，材料黄鳝购自连云港市水产品市场。实验用指示菌嗜水气单胞菌(爿era"o/my场(iro/m7a)、枯草芽孢杆菌(5ac/〃wssw&z7&)、白色念珠菌a/6/c<ms)、大肠杆菌(E^c/zm.c/n.aco//)、金黄色葡萄球菌)、鳗弧菌(J^n'o朋gw7aram)和鲁克氏耶尔森菌(Fe^/m'"n^fe"。菌种均是申请人实验室储备。采用抑菌圈法进行抑菌实验时，以无菌水为对照。以下是发明人以本发明目标产物MAS-W-3、MAS-IV-4黄鳝抗菌肽所做的相关实验。1、凝血实验。取0.1mL鸡血浆，加入10uL样品。混匀后，于37。C保温5min，转至室温，加入6.25uL、0.4mol/L的CaCl2，观察记录凝血时间。结果表明在MAS-IV-3和MAS-IV-4中未检测到凝血活性。2、溶血实验。将新鲜鸡血置于装有柠檬酸钠(最终浓度为0.38%)的离心管中离心(2000r/min、4°C、5min)。用生理盐水洗至上清不再出现红色为止。将洗涤好的红细胞稀释成2%的细胞悬浮液备用。取红细胞悬浮液20yL，分别加MAS-W-3、MAS-IV-4溶液20uL(以无菌水代替样品为对照)，用生理盐水补足至1.0mL，于37。C的恒温水浴锅中保温30min;4°C、2000r/min离心5min，上清液于540nm测吸光值。溶血活性与吸光值成正比。结果表明，MAS-W-3、MAS-W-4均有微弱的溶血活性。下表中的数值是540nm下的吸光值，从表中可以看出，其具有微弱的溶血活性。表l黄鳝皮肤黏液提取液离子交换层析分离峰溶血活性检测<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、小白鼠痛觉测定实验。实验步骤..把恒温水浴的水温调解至55士0.5。C，取一个大烧杯置于恒温水浴锅中(烧杯底部一定要接触水面)。左手轻轻抓住小白鼠背部，在将小白鼠放入烧杯内的同时用秒表记时。记录小白鼠自放入烧杯至添支撑足所需时间(s)，即该小白鼠的痛阈值。选用痛阈值在3—30s的小白鼠作为痛觉实验对象。将上述合格的小白鼠分为2组，每组3只，每组分别腹腔注射MAS-IV-3、MAS-IV-4溶解液和生理盐水各0.5mL。给药30s后测定各组的痛阈值。若小白鼠在热板上停留60s仍无疼痛反应，应予取出，其痛阈值以60s计算。将各组每个小白鼠所测的痛阈值按王心如等2003年出版的《毒理学实验方法与技术》提出的公式计算用药后痛阈值提高的百分率，并考察样品对小白鼠痛觉功能的影响。结果表明MAS-IV-3、MAS-IV-4对小白鼠的痛觉有影响即具有镇痛作用。表2.注射样品前9只小白鼠的痛阈值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4、丝氨酸蛋白酶抑制剂活性检测。由于MAS-IV-3样品较少，以后相关实验只对MAS-IV-4进行研究。在1.5mL比色皿中依次加入Tris-HCl缓冲液(0.05mol/LpH7,8)410、胰蛋白酶(Tripsin)50、MAS-IV-4溶液20^L，迅速用1cm2的封口膜封口并上下颠倒混匀，室温下静置5min。再加丝氨酸蛋白酶显色底物NBLAN(苯甲酰一L-精氨酸硝酸还原酶氢氯化物)40|iL，迅速置入BioTekSynergyHT酶标仪，设置振荡10s，每30s检测一次A4。5，总计检测3min。以Tris-HCl缓冲液替代MAS-IV-4溶液为对照，通过比较AA值检测丝氨酸酶抑制剂活性。结果如图5所示，可见MAS-IV-4趋势线的斜率略小于对照，表明MAS-IV-4有微弱的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。5、黄鳝抗菌肽MAS-IV-4的纯度鉴定。采用2种方法对抗菌肽MAS-IV-4的纯度进行鉴定。一是Trcine-SDS-PAGE电泳，并做了如下改进。1)胶浓度为15%、交联度为5%;2)内槽加入负极电泳缓冲液，外槽加入正极电泳缓冲液，形成Trcine-SDS-PAGE电泳系统；3)分离胶中经恒流30mA电泳3h，固定1h，染色2h和脱色。结果表明MAS-W-4有较高纯度。二是熔点法测定，用上海精密科学仪器有限公司生产的X-4显微熔点仪测定，结果表明MAS-IV-4熔点在208"C2irC，也说明该样品有较高纯度。图l为一次筛选所得分离图谱(其中图谱1为A22。；图谱2为A，)；图2为一次筛选所得分离峰的一种抑菌(嗜水气单胞菌)效果图3为一次筛选所得分离峰的一种抑菌(枯草芽孢杆菌)效果图4为一次筛选所得分离峰的一种抑菌(白色念珠菌)效果图；图5为一次筛选所得分离峰的一种抑菌(金黄色葡萄球菌)效果图；图6为一次筛选所得分离峰的一种抑菌(大肠杆菌)效果图；图7为MAS-IV经离子交换层析分离图谱；图8为MAS-IV离子交换层析分离峰的一种抑菌(嗜水气单胞菌)效果图；图9为MAS-W离子交换层析分离峰的一种抑菌(枯草芽孢杆菌)效果图；图10为MAS-IV离子交换层析分离峰的一种抑菌(金黄色葡萄球菌)效果图11为丝氨酸蛋白酶抑制剂活性检测结果图(注图中虚线为对照，实线MAS-IV-4)。具体实施例方式以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一歩地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例l。一种黄鳝抗菌肽的制备工艺，其步骤如下(1)黏液制备黄鳝放入水中排除体内杂物后，将黄鳝分别置于标本缸中，撒适量氯化钠于黄鳝体表刺激黄鳍蠕动，收集黄鳝皮肤黏液；(2)上清液制备将黄鳝皮肤黏液于4°C、12000rpm高速冷冻离心20min，取上清液，然后将上清液以厚度不超过2mm分装于若干培养皿中，再用保鲜膜封盖，-4(TC冷冻保存备用；(3)干粉制备取-4(TC冷冻保存24h以上的上述培养皿，在封盖保鲜膜上扎若干个孔，即时用真空冷冻干燥机对其进行冷冻干燥浓縮，获黄鳝皮肤黏液的干粉；(4)一次筛选称取干粉5-10g，5-10mLPBS缓冲液溶解，-4"离心1.5min，取上清液为样品；测定样品A28o;然后选用2.6cmX100cm层析柱，SephadexG-50填料，pH6.0、0.1mol/LPBS洗脱液，按常规方法用SephadexG-50装柱后，以6s—滴的速度平衡柱子24h，将总OD为200-300的样品滴加至SephadexG-50凝胶柱表面，让样品自然或6s—滴的速度流入S印hadexG-50凝胶柱中；安装好层析系统，以10s—滴的速度洗脱，自动收集器收集，得每管3mL的按序编号的收集管若干;测定各收集管中A，和A220，以收集管序号为横坐标、八280和八22()为纵坐标，制作分离图谱，获得4个分离峰，分别命名为MAS-I、MAS-II、MAS-III和MAS-IV;参照图l;(5)二次筛选采用抑菌圈法进行抑菌实验筛选；实验用指示菌为嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌和鲁克氏耶尔森菌；将上述7种菌种制备成A,=0.06的菌悬液，取100涂布于LB培养基上，用微量移液器取20分离液浸润滤纸，将滤纸片放于涂布菌悬液的培养基上；筛选得到对大肠杆菌、嗜水气单胞菌，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有抑菌效果的MAS-W;参照图2-6;(6)MAS-IV溶液透析:12000r/min，4。C离心MAS-IV5min，取出上清液，放入透析袋(截留分子量3500)中，用Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH7.8)透析2-4h，中间更换缓冲液1-2次；(7)MAS-IV离子交换层析选用12mmX200mm(实装160mm)层析柱，DEAESepharoseFastFlow填料，BiologicDuoflow蛋白质层析系统，利用含0.8mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH7.8)进行梯度洗脱，NaCl浓度从0%-100%，洗脱5个柱体积(108mL)，流速1.00mL/min;根据BiologicDuoflow蛋白质层析系统配套软件显示的分离峰，分别收集7个分离峰，并依次命名为MAS-W-1，MAS-W-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV-7;参照图7;(8)MAS-IV离子交换层析产物的浓缩将MAS-IV-1，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV-7分别分装于培养皿中，厚度不超过2mm，并用保鲜膜封盖，置-40'C冰箱冷冻；24h后取出培养皿，在封盖保鲜膜上扎孔，即时用真空冷冻千燥机对其进行冷冻干燥浓縮，获各分离峰干粉；(9)三次筛选采用步骤(5)中所述的方法进行再一次的筛选用抑菌实验;用适量无菌水溶解上述各分离峰干粉制成样品液；筛选得到MAS-W-3、MAS-IV-4对嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌活性；最终得到目标产物MAS-IV-3、MAS-IV-4黄鳝抗菌肽；参照图8-10。权利要求1、一种黄鳝抗菌肽的制备工艺，其特征在于，其步骤如下(1)黏液制备黄鳝放入水中排除体内杂物后，将黄鳝分别置于标本缸中，撒适量氯化钠于黄鳝体表刺激黄鳝蠕动，收集黄鳝皮肤黏液；(2)上清液制备将黄鳝皮肤黏液于4℃、12000rpm高速冷冻离心20min，取上清液，然后将上清液以厚度不超过2mm分装于若干培养皿中，再用保鲜膜封盖，-40℃冷冻保存备用；(3)干粉制备取-40℃冷冻保存24h以上的上述培养皿，在封盖保鲜膜上扎若干个孔，即时用真空冷冻干燥机对其进行冷冻干燥浓缩，获黄鳝皮肤黏液的干粉；(4)一次筛选称取干粉5-10g，5-10mLPBS缓冲液溶解，-4℃离心15min，取上清液为样品；测定样品A280；然后选用2.6cm×100cm层析柱，SephadexG-50填料，pH6.0、0.1mol/LPBS洗脱液，按常规方法用SephadexG-50装柱后，以6s一滴的速度平衡柱子24h，将总OD为200-300的样品滴加至SephadexG-50凝胶柱表面，让样品自然或6s一滴的速度流入SephadexG-50凝胶柱中；安装好层析系统，以10s一滴的速度洗脱，自动收集器收集，得每管3mL的按序编号的收集管若干；测定各收集管中A280和A220，以收集管序号为横坐标、A280和A220为纵坐标，制作分离图谱，获得4个分离峰，分别命名为MAS-I、MAS-II、MAS-III和MAS-IV；(5)二次筛选采用抑菌圈法进行抑菌实验筛选；实验用指示菌为嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌和鲁克氏耶尔森菌；将上述7种菌种制备成A600＝0.06的菌悬液，取100μL涂布于LB培养基上，用微量移液器取20μL分离液浸润滤纸，将滤纸片放于涂布菌悬液的培养基上；筛选得到对大肠杆菌、嗜水气单胞菌，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有抑菌效果的MAS-IV(6)MAS-IV溶液透析12000r/min，4℃离心MAS-IV5min，取出上清液，放入透析袋中，用Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH7.8)透析2-4h，中间更换缓冲液1-2次；(7)MAS-IV离子交换层析选用12mm×200mm层析柱，DEAESepharoseFastFlow填料，BiologicDuoflow蛋白质层析系统，利用含0.8mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，NaCl浓度从0％-100％，洗脱5个柱体积，流速1.00mL/min；根据BiologicDuoflow蛋白质层析系统配套软件显示的分离峰，分别收集7个分离峰，并依次命名为MAS-IV-1，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV-7；(8)MAS-IV离子交换层析产物的浓缩将MAS-IV-1，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV-7分别分装于培养皿中，厚度不超过2mm，并用保鲜膜封盖，置-40℃冰箱冷冻；24h后取出培养皿，在封盖保鲜膜上扎孔，即时用真空冷冻干燥机对其进行冷冻干燥浓缩，获各分离峰干粉；(9)三次筛选采用步骤(5)中所述的方法进行再一次的筛选用抑菌实验；用适量无菌水溶解上述各分离峰干粉制成样品液；筛选得到MAS-IV-3、MAS-IV-4对嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌活性；最终得到目标产物MAS-IV-3、MAS-IV-4黄鳝抗菌肽。全文摘要本发明是一种黄鳝抗菌肽的制备工艺，其特点是，其步骤如下黏液制备黄鳝放入水中排除体内杂物后，将黄鳝分别置于标本缸中，撒适量氯化钠于黄鳝体表刺激黄鳝蠕动，收集黄鳝皮肤黏液；将黄鳝皮肤黏液制备上清液、干粉，再进行一次筛选，获得4个分离峰；然后再进行二次筛选，筛选得到对大肠杆菌、嗜水气单胞菌，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有抑菌效果的MAS-IV；然后对MAS-IV进行三次筛选，筛选得到最终得到目标产物MAS-IV-3、MAS-IV-4黄鳝抗菌肽；MAS-IV-3、MAS-IV-4黄鳝抗菌肽对嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌具有抑菌活性。文档编号C07K1/18GK101348519SQ20081019586公开日2009年1月21日申请日期2008年9月5日优先权日2008年9月5日发明者安贤惠,李联泰,浦寅芳申请人:淮海工学院