专利名称：一种抗菌肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种新型的抗菌肽及其该抗菌肽在制备用于控制微生物感染的治疗药物组合物中的应用，属于多肽技术领域。
背景技术：
抗生素是能抵抗致病微生物的药物，是抗菌消炎药中最大的ー类。抗生素是由细菌、真菌或其他微生物在生活过程中所产生的物质，具有抑制或杀灭细菌、真菌、螺旋体、支原体、衣原体等致病微生物的作用，因此作为抗感染药物。还有的抗生素可治疗恶性肿瘤。抗生素类药物广泛地应用于各种感染性疾病，其品种繁多。阳离子抗菌肽可以代表ー类新型的抗生素，虽然阳离子抗菌肽的作用模式尚未完全确定，但所有的阳离子两亲性抗菌肽 都会与细胞膜相互作用，细胞膜是抗菌肽的主要靶点，抗菌肽分子在细胞膜上的聚集会导致通透性的増加并使细胞膜丧失其屏障功能。产生这种抗药性需要对微生物细胞膜脂成分的实质性改变，因此，针对这些膜活性的抗菌肽产生抗药性是几乎不可能的。QT -螺旋型和β -折叠型抗菌肽是最主要的两大类阳离子抗菌肽。(3_折叠
型抗菌肽包括由分子内ニ硫键固定的环形多肽，例如防卫素和保护素，以及具有N末端到
c末端的共价键的多肽，例如短杆菌肽s和短杆菌酪肽。与β-折叠型抗菌肽不同，QC
-螺旋型抗菌肽是更加线性的分子，其在水介质中以无序结构存在，但它们通过与疏水细胞膜相互作用，呈两亲螺旋状态，例如蛾血素，马加宁和蜂毒肽。生物学研究表明Qt -螺旋型抗菌肽的药理活性及溶血活性一般与抗菌肽的疏
水性、两亲性及螺旋性相关。多数情况下，D-型氨基酸取代L-型氨基酸形成的抗菌肽，其螺旋度会降低，从而其毒性(溶血活性)也随之降低。而用疏水性更高的氨基酸取代疏水性较低的氨基酸所形成的多肽会具有更强的抗菌活性。通过利用一系列选定的D-或者L-型氨基酸替换在这些两亲分子的非极性和极性面上特定位置的疏水或者亲水的氨基酸残基，我们设计出了具有更高抗菌特异性的抗菌肽。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种抗菌肽，通过人工合成即多肽固相合成的方法制备可以用作抗微生物制剂的多肽及其相关化合物，解决日益严重的抗药性问题及顽固感染对广大患者造成的痛苦。其抗菌作用起效稳定，无毒性，易于人体接受。本发明的另ー个目的在于提供ー种抗菌肽在制备用于控制微生物感染的治疗药物组合物中的应用，可以应用于各种顽固感染性疾病及普通感染，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。本发明的技术方案为ー种抗菌肽，其特征在于衍生自Ac-Lyslj-Trplj-Lyslj-Serlj-PheL—LeuL—
LysL-ThrL-PheL-LysL-SerL-AlaL-LysL-LysL-ThrL-ValL-LeuL-HisL-ThrL-AlaL-LeuL-LysL-AlaL-IleL-SerL-SerL-NH2 (代码为NlQ序列的ー种新型多肽，其氨基酸的序列为Ac-LysL-TrpL-LysL-SerL-
PheL-LeuL-Ly sL-ThrL-PheL-LysL-SerL-LeuD-Ly sL-Ly sL~Thr L-ValL-LeuL-HisL-ThrL-LeuD-Leul-LysL-AlaL-IIeL-SerL-SerL-NH2(命名为SQ-I),序列中下脚标分别表不该位置氨基酸为L-型或者D-型氨基酸，Ac代表N-端こ酰化，NH2代表C-端酰胺化。SQ-I在NI^序列基础上，将疏水面第12及20位上的疏水性较低的Ala^取代为疏水性较高的LeuD，由于Leu疏水性高于Ala，因而使得其抗菌活性増加，用D-型取代L-型氨基酸，又降低了 SQ-I序列的螺旋度，从而使得其溶血活性降低，最终达到到优化的目的，得到相对NKl序列特异性更高的优选多肽，抗菌活性增强，同时细胞毒性(溶血活性)降低。以下所述SQ-I系列多肽的取代方式均基于这种设计理念衍生。例如，多肽类似物SQ-25 氨基酸序列为=Ac-Lyslj-Trplj-Lyslj-Serlj-Phelj-Leulj-Ly slj-ThrL-PheL-
Lysl-Ser, -Leul-LysL-LysL-Thr,-Val, -Leul-Hi sL-ThrL-Leu, -Leul-LysD-AIaL-11 e, -Ser, _SerfNH2,是通过将SQ-I疏水面12位及20位上的Leu11取代为Lei^同时将亲水面第22位上的L5^换成LysD，这种取代便是为了得到特异性更强的多肽序列。本发明优选多肽SQ-I及其多肽类似物SQ-25，其含有下面氨基酸序列。表I多肽及其氨基酸序列
^ 产SIfU单字#.If列
Ac -Ly Sie-Trpia -Lv $i -Bhti -Levir-LysL-Thri,Ac -K4- Wl-El - Sll -Fl-i
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IetiL-L-&UL -Ly sp-Alat -B&l-Sen,-Sert -NIfeLl -Ll-Kp-Al-Ii.: Sl-:
这里，表中氨基酸后面的下标字母D代表该氨基酸是D-型氨基酸；与此相同，下标L代表该氨基酸是L-型氨基酸。Ac表示多肽的N端被こ酰化，NH2表示C端酰胺化。所述的抗菌肽氨基酸序列中的Leu由lie, Val,正亮氨酸，正缬氨酸中任ー氨基酸残基取代。所述的抗菌肽氨基酸序列中的Phe由Trp, Tyr, Leu, He, Val,正亮氨酸，正缴
氨酸中任一氨基酸残基取代。所述的抗菌肽氨基酸序列中的Trp由Phe, Tyr, Leu, He, Val,正亮氨酸，正
缬氨酸中任一氨基酸残基取代。所述的抗菌肽及相应的对映异构体的任意1-2个氨基酸可由L-型或D-型氨基酸取代。所述的抗菌肽序列中以不同方式取代其中1-2个氨基酸或延长多肽序列及截短多肽序列1-2个氨基酸的方式所得到相似的序列及其的相关化合物。抗菌肽在制备控制微生物感染的药物组合物中的应用。
所述的药物组合物中抗菌肽的剂量范围为注射剂O. l-50mg/kg;外用剂1/10000-10%/ 支。本发明的积极效果是经过改造后的SQ-I系列抗菌肽较源序列NKl具有更高的抗菌活性，或毒性降低，或抗菌特异性更强。可以用作人类药物和/或牲畜药物、兽用药物或者作为农业、食品及エ业上有效的化合物试剂。我们发现抗菌肽的ー些物理特性对于其抗菌活性是至关重要的。这些特性包括在亲水PH值下带有适宜的电荷数，同时存在疏水残基与碱性残基，将疏水残基与碱性残基
分开的两亲性，可诱导的或预先形成的ニ级结构((X -螺旋或β -折叠)。在临床实践中，微生物感染包括细菌、病毒、真菌或原生动物的ー种或多种病原体所引起的感染。例如，两种不同的细菌同时引起的感染等。然而，临床检测是哪种感染的过 程及确定治疗方案，相对繁琐。通过ー种给药方式(抗菌肽)，可治疗复杂型及耐药型病原体感染。本发明中利用多肽固相从头设计的技术，在NKl序列基础上进行优化，合成得到了SQ-I及其类似物。这些多肽具有非常强的抗菌活性，同时对人体细胞毒性很低。序列组成上，这些多肽与SQ-I的氨基酸同源性均在90%以上(可由24-28个同源氨基酸组成，详见实施例I中序列信息表)。本发明所述的多肽分子在疏水环境中呈一定的ニ级结构(例如螺旋结构)。我们已经利用圆二色谱(CD)监测了抗菌肽分子在50%三氟こ醇(细胞膜疏水环境的模拟)中的
OL-螺旋结构。本发明优选的抗菌肽是具有潜在的生物学活性的螺旋类似物，通过圆二色谱检测，该抗菌肽在亲水环境中(如含有100 mM氯化钾，pH7的50 mM磷酸缓冲液)具有很少的
CC.-螺旋结构。该结构特征可能对抗菌肽活性机理有重要意义，例如a)降低在亲水环
境中形成聚合体的能力，即自我相互作用能力山)允许抗菌肽分子更容易穿过细胞壁到达
微生物的细胞膜。并且，在亲水环境中对CX-螺旋结构的破坏，不会对抗菌肽(正电性)
与微生物的细胞壁(负电性)的静电吸引作用产生影响；然而，特定结构的缺少可以降低细胞壁表面对抗菌肽的亲和作用(细胞壁中的疏水基团与多肽疏水面的疏水相互作用)，从而允许抗菌肽更易于通过细胞壁，进入到细胞膜的亲/疏水的临界面，在该区域抗菌肽与膜
表面呈平行状态。在膜内，抗菌肽可以被细胞膜的疏水环境诱导成OC-螺旋结构。由于
此(X -螺旋结构，我们猜测抗菌肽的非极性面可以和细胞膜的疏水部分相互作用，而其
极性面上的极性基团和带正电的基团可以和细胞膜表面上磷脂极性头部(负电性)相互作用。当抗菌肽呈OC-螺旋结构时,抗菌肽分子呈现带净正电和两亲性。例如，OC-螺旋型抗菌肽在分子的一侧有非极性或疏水表面，在分子另ー侧有极性或者带正电荷的表面，即两亲性分子。通过高效液相色谱反相柱RP-HPLC的温度监控技术，在5°C 80°C的范围内，对ー些抗菌肽类似物在溶液中的自我相互作用的能力进行评估。抗菌肽的自我相互作用能力是衡量其抗菌活性与溶血活性的另ー个重要指标。上述抗菌肽及其组合物可以制备为任何一种医学上可用的生物载体或制剂形式给予感染疾病患者。本发明原料药优选制剂剂量范围是O. 01-500mg重量份。制备本发明注射制剂常用辅料包括こニ胺四こ酸ニ钠、吐温80、甘露醇、甘油、
丙ニ醇。制备本发明ロ服固体制剂常用的辅料包括微晶纤维素、低取代-羟丙基纤维素、·聚こ烯吡咯烷酮、微粉硅胶、淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁、羧甲基淀粉钠、交联聚こ烯吡咯烷酮、预胶化淀粉等。制备本发明外用制剂所述常用辅料包括甘露醇、聚山梨酷-80、聚こニ醇、硬脂酸聚烃氧酷、甘油、卡波姆、三こ醇胺、こ醇、聚こ烯吡咯烷酮、酒石酸、碳酸氢钠、聚こ烯醇、苯甲酸钠、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素等。制备本发明ロ服液体制剂辅料包括こ醇、羟苯こ酷、羟苯甲酷、聚山梨酷-80、苯甲酸钠、山梨酸、蜂蜜、蔗糖、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、抗坏血酸、硫脲、こニ胺四こ酸ニ钠、磷酸、枸櫞酸、甘油、乳糖等。上述原料组分可与一定比例的常用药用辅料相配，按照本领域常规方法可制成包含注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、ロ服液、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、滴眼剂、喷雾剂、气雾剂、贴齐 、涂膜剂、洗剂中的ー种。所述抗菌剂中抗菌肽的剂量范围为注射剂O. l-500mg/kg ;外用剂1/10000-10%/支。
图I为SQ-I的氨基酸序列及螺旋轮和螺旋网示意图。图2为SQ-25的氨基酸序列及螺旋轮和螺旋网示意图。图3为抗菌肽NKl与SQ-1，SQ-25比较的圆二色谱图。图4为抗菌肽NKl与SQ-I，SQ-25温度曲线及自我相互作用能力的比较。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明做进ー步详细说明。实施例I衍生自SQ-I的相关抗菌肽序列信息
多肽SQ-I是由26个氨基酸残基所组成,序列为Ac-LysirTrplj-LysirSerlj-Phelj-LeuirLy
Sf
ThrL-Phe, _Ly sL_berL_LeuD_Ly s, -Lys, _ mrL- V^a I L-LeuL-Hi s, -ThrL-LeuD-LeuL-Lys, _ 八 _Ileli-Serlj-Serlj-NH2,衍生于NKlj序列的抗菌肽。SQ-I为具有一个极性表面和一个非极性表面的两亲性α-螺旋型抗菌肽，在本研究中作为模板多肽。它的极性表面由14个亲水氨基酸(6个赖氨酸，4个丝氨酸，3个苏氨酸，I个组氨酸)组成。相比之下，其非极性表面含有11个疏水氨基酸(I个色氨酸，2个苯丙氨酸，5个亮氨酸，I个缬氨酸，I个丙氨酸，I个异亮氨酸)和I个亲水氨基酸(I个赖氨酸)组成。
通过多种不同方式取代其中某些氨基酸或延长及截短多肽序列的方式，我们筛选得到了系列SQ-I多肽类似物。图I(A)表明在本发明中优选的多肽SQ-1/SQ25的氨基酸序列及螺旋轮图形，图I (B、C)表明SQ-l、SQ-25螺旋网图形；其中带四方框的氨基酸表示位于螺旋的非极性/疏水表面的疏水氨基酸，带圆圈的氨基酸表示位于极性/亲水表面上的亲水氨基酸，三角形框中的氨基酸表示位于疏水面上的亲水氨基酸。在螺旋轮图I (A)中，亲水表面用空心的弓形表示，疏水表面用实心的弓形表示。Ac指N端こ酰化，NH2指C端酰胺化。氨基酸残基用单字母编码表示并以此为基础进行进一歩改造，得到了ー组活性基本一致的相关抗菌多肽。多肽SQ-I主要是由L-型氨基酸组成(其中仅第12及20位的亮氨酸为D型氨基酸)，我们设计了其对映异构体多肽SQ-2主要由对应的D-型氨基酸组成(其中仅第12及20位的亮氨酸为L型氨基酸)。因此，SQ-2在立体化学上与相应的SQ-I完全相反。已有大量研究工作表明，对映异构体多肽在各种理化性质及生物活性方面一致，因而在本文本中下述实施例中，仅选列了其中部分代表性多肽序列的实验数据。SQ-3及SQ-5为不同带电氨基酸取代形成的多肽类似物之一，通过选择取代SQ-I序列中氨基酸改变带电氨基酸的性能而得到的。选择用于取代的氨基酸优选是带电荷的氨基酸，特别是净电荷为带正电荷的氨基酸。带电荷的氨基酸包括Lys、Arg、Orn、His、ニ氨基 丁酸和ニ氨基丙酸。Orn具有δ-氨基来替代Lys的ε -氨基，即其侧链减少ー个碳原子；ニ氨基丁酸具有Y氨基，即其比Orn的侧链少ー个碳原子；ニ氨基丙酸比Orn支链少两个碳原子，即具有β氨基。SQ-4及SQ-6为上述两条多肽的对映异构体。SQ-7、SQ_9和SQ -11为多点取代SQ-I形成的多肽类似物。在发明多肽的不同位点进行多点取代形成的多肽(如三位点取代)能够依然保持活性。对于多点取代形成的特定多肽，这样的在非极性面中心的多点取代至少会与单点取代具有同样的效果。考虑到多肽序列的氨基酸组成，特别是疏水氨基酸在生物活性中的重要性，认为具有与SQ-I序列的氨基酸组成90%以上的相似度的多肽，具有很好的生物学活性。SQ -8,SQ-10及SQ -12为上述三条多肽的对映异构体。SQ-13、SQ-15和SQ-17为对多肽的N端和C端的氨基酸进行截取，获得比发明多肽更短的多肽，这种去除SQ-I —端或两端1-2个氨基酸而产生的多肽，其氨基酸相似性仍在90%以上，从而保持与SQ-I抗菌相当的活性。SQ-14、SQ-16及SQ-18为上述三条多肽的对映异构体。多肽表面的疏水氨基酸通过疏水相互作用，构成多肽整体疏水面。SQ-I的非极性表面上由疏水氨基酸W2，F5，L6，F9，LD12，V16，L17，LD20, L21，A23，124和一个亲水氨基酸K13 组成。同样，极性表面由 Kl, K3, S4, K7, T8, K10, Sll, K14, T15, H18, T19, K22, S25, S26组成。对组成SQ-I的氨基酸残基特别是疏水氨基酸进行重组(可以是将非极性表面上疏水氨基酸残基进行重组，或者将极性表面上的极性氨基酸残基进行重组，或者在极性表面及非极性表面进行氨基酸残基的重组而不会实质改变多肽分子的两亲性的组合)组成的多肽仍然具有很好的生物学活性，SQ-19、SQ-21和SQ-23为部分序列信息(选取了任意2个氨基酸进行位点互換)，这种重组在氨基酸组成同源性中与SQ-I保持了 100%的同源性，其活性与SQ-I抗菌活性相当。SQ-20、SQ-22及SQ-24为上述三条多肽的对映异构体。SQ-25及SQ-27为SQ-I同一位点氨基酸L-型与D-型的互換式取代形成的多肽类似物。这种互換式取代保持了氨基酸侧链长度引起的疏水性，但适度降低多肽整体的疏水性和螺旋度，因而能在保持其抗菌活性同时降低其细胞毒性。SQ-26及SQ-28为上述两条多肽的对映异构体。表2部分多肽序列信息汇总表
权利要求
1.一种抗菌肽，其特征在于其氨基酸的序列为Ac-LysL-TrpL-LysL-SerL-PheL-LeuL_LysL-ThrL-PheL-LysL-SerL-LeuD-LysL-LysL-ThrL-ValL-LeuL-HisL-ThrL-LeuD-LeuL-LysL-AlaL-IleL-SerL-SerL-NH2 (SQ-I)0
2.根据权利要求I所述的一种抗菌肽，其特征在于所述的抗菌肽SQ-I类似物即命名为SQ-25的氨基酸序列为Ac-Ly sL-TrpL-LysL-SerL-PheL-LeuL-LysL-ThrL-PheL-LysL-SerL-LeuL-Ly sL~Ly sL-ThrL-ValL-LeuL-HisL-ThrL-LeuL-LeuL-LysD-AlaL-IleL-SerL-SerL-NH2。
3.根据权利要求1，2所述的一种抗菌肽，其特征在于所述的抗菌肽氨基酸序列中的Leu由lie，Val,正亮氨酸，正缬氨酸中任一氨基酸残基取代。
4.根据权利要求1，2所述的一种抗菌肽，其特征在于所述的抗菌肽氨基酸序列中的Phe由Trp，Tyr，Leu，He, Val,正亮氨酸，正缬氨酸中任一氨基酸残基取代。
5.根据权利要求1，2所述的一种抗菌肽，其特征在于所述的抗菌肽氨基酸序列中的Trp由Phe，Tyr, Leu, He, Val,正亮氨酸，正缬氨酸中任一氨基酸残基取代。
6.根据权利要求1，2所述的一种抗菌肽，其特征在于所述的抗菌肽及相应的对映异构体的任意一个或几个氨基酸可由L-型或D-型氨基酸取代。
7.根据权利要求1，2所述的一种抗菌肽，其特征在于所述的抗菌肽序列中以不同方式取代其中1-2个氨基酸所得到的相似的序列及其的相关化合物。
8.根据权利要求1，2所述的一种抗菌肽，其特征在于延长多肽序列及截短多肽序列I-2个氨基酸的方式所得到的相似的序列及其的相关化合物。
9.一种抗菌肽在制备控制微生物细菌和真菌感染的药物组合物中的应用。
10.根据权利要求1，2所述的一种抗菌肽，其特征在于所述的药物组合物中抗菌肽的剂量范围为注射剂0. l-50mg/kg ;外用剂1/10000-10%/支。
全文摘要
本发明公开了一种抗菌肽及其应用，其氨基酸的序列为Ac-LysL-TrpL-LysL-SerL-PheL-LeuL-LysL-ThrL-PheL-LysL-SerL-LeuD-LysL-LysL-ThrL-ValL-LeuL-HisL-ThrL-LeuD-LeuL-LysL-AlaL-IleL-SerL-SerL-NH2(SQ-1)，及其衍生序列Ac-LysL-TrpL-LysL-SerL-PheL-LeuL-LysL-ThrL-PheL-LysL-SerL-LeuL-LysL-LysL-ThrL-ValL-LeuL-HisL-ThrL-LeuL-LeuL-LysD-AlaL-IleL-SerL-SerL-NH2(SQ-25)。本发明通过多肽固相合成的技术合成了可以用做抗微生物制剂的多肽及其相关化合物，解决日益严重的抗药性问题，解决顽固感染对广大患者造成的痛苦。本发明中的抗菌肽可以应用于各种顽固感染性疾病及普通感染，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。
文档编号C07K14/00GK102731629SQ201210157559
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者李杨, 陈明侠, 陈育新, 黄宜兵 申请人:长春普莱医药生物技术有限公司